新生小鼠心肌干細(xì)胞培養(yǎng)與分化的研究.pdf

1、背景： 成體心臟內(nèi)存在具有特異性心肌分化潛能的多能干細(xì)胞，成體心肌干細(xì)胞(Cardiac stem cells CSC)是存在于發(fā)育成熟機體心臟組織中的具有高度自我更新和特異性心肌分化、增殖潛能的未分化細(xì)胞。它具有以下幾點主要的細(xì)胞生物學(xué)特性：①具有克隆能力、能夠自我更新和有多能性；②能迅速發(fā)育成結(jié)構(gòu)和功能成熟的心肌細(xì)胞和血管系統(tǒng)；③只需在損傷局部激活、遷移，不需采集和擴增。 目的： 研究新生小鼠心肌干細(xì)胞原代和

2、傳代的培養(yǎng)及其分化潛能，為缺血及壞死心肌重建的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 內(nèi)容： 1．在過去研究方法的基礎(chǔ)上，進行改良，成功建立一種更加穩(wěn)定、高效的體外成體心肌干細(xì)胞分離、純化的方法。 2．誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞分化為搏動的心肌細(xì)胞。 3．通過免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞儀、RT-PCR等鑒定方法，基本明確細(xì)胞表型，并將原有的方法與改良后的方法進行比較。 方法： 1．原有的方法是組織塊貼壁法，僅僅使用眼科剪

3、刀將心肌組織剪碎，用培養(yǎng)液潤洗后，必須要等待組織塊貼壁之后才能添加培養(yǎng)液，組織塊很容易漂浮起來。經(jīng)過不斷的觀察和實驗，將原有方法進行改良，采用微小組織塊懸浮貼壁法，在用剪刀將心肌組織剪碎的基礎(chǔ)上，經(jīng)過胰酶消化，棄去消化液，使用膠頭滴管反復(fù)吹打組織塊后離心，加入CEM培養(yǎng)液重懸后進行培養(yǎng)。 2．待其長滿培養(yǎng)瓶后進行傳代，傳代細(xì)胞用CGM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，約1-2周可見單個搏動的傳代細(xì)胞，也可見成團細(xì)胞的同步收縮。 3．免疫熒

4、光染色法標(biāo)記原代與傳代細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞表面是否帶有c-kit、Sca-1、MHCⅡ熒光。 4．流式細(xì)胞儀鑒定原代與傳代細(xì)胞表面標(biāo)記c-kit、Sca-1、MHC Ⅱ、CD34、CD8。 5．半定量RT-PCR檢測原代與傳代細(xì)胞心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4的表達。 結(jié)果： 1．采用改良后的方法從消化后的心肌組織塊中成功培養(yǎng)得到原代細(xì)胞，進行免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀鑒定其表型為c-kit、Sca-1

5、陽性的細(xì)胞，表面不表達CD34、CD8、MHCⅡ。 2．細(xì)胞經(jīng)傳代后培養(yǎng)l周左右，開始出現(xiàn)搏動，也可見成團細(xì)胞的同步收縮。再次經(jīng)免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀鑒定其表型為c-kit、sca-1陰性，MHCⅡ陽性，仍然不表達CD34、CD8。 3．半定量RT-PCR檢測原代細(xì)胞不表達心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4，而傳代培養(yǎng)1周后的細(xì)胞開始表達GATA-4。 4．統(tǒng)計學(xué)方法分析實驗結(jié)果，原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞共經(jīng)過8次流式細(xì)胞儀

6、檢測表面標(biāo)記物陽性的細(xì)胞所占的百分比后，所得到的數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用配對樣本的，檢驗方法來比較表面標(biāo)記物陽性的原代與傳代細(xì)胞所占百分比的差異，P 值代表兩者之間的差異性，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。其中c-kit、Sca-1、MHC Ⅱ三種抗體陽性的細(xì)胞所占百分比的 P 值小于0.05，差異有顯著性；而CD34、CD8兩種抗體陽性的細(xì)胞所占百分比的 P 值大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。 5．另外，采

7、用兩樣本的 t 檢驗方法比較同一批培養(yǎng)的原代和傳代細(xì)胞，分別使用原方法與改良后的方法進行培養(yǎng)，所得到的細(xì)胞表面標(biāo)記物陽性所占百分比的差異，P值代表兩者之間的差異性，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)無論是原代細(xì)胞還是傳代細(xì)胞，分別使用兩種方法的c-kit、Sca-1、MHC Ⅱ三種抗體標(biāo)記的陽性細(xì)胞所占百分比的 P 值均小于0.05，兩者的差異有顯著性，有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1．在原有方法的基礎(chǔ)上，通過對其進