兔骨髓間充質干細胞培養(yǎng)、凍存及體外分化為胰島β細胞的研究.pdf

1、糖尿病作為嚴重危害人類健康的一類代謝性疾病，世界上患病人口逐年增多。胰島移植可以治療糖尿病，卻面臨著供體缺乏和移植免疫排斥問題，細胞替代治療的可行性顯著，研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細胞(ESCs)、誘導多潛能干細胞(iPS)以及成體干細胞(AS)可以體內、外誘導分化為胰島素分泌細胞，分化細胞可改善、逆轉糖尿病動物的高血糖癥，為移植細胞替代治療糖尿病提供了可能性。骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)是存在于骨髓腔內非造血干細胞類的成體干細胞，可以避免

2、利用胚胎干細胞涉及的倫理問題和誘導性干細胞所產(chǎn)生的技術性問題。如何誘導BM-MSCs穩(wěn)定、高效地分化為功能完全的胰島β細胞是目前亟待解決的問題。本試驗擬在體外分離培養(yǎng)兔BM-MSCs的基礎上，對凍存細胞的增殖能力、生物學特性進行鑒定，優(yōu)化并建立穩(wěn)定的兔BM-MSCs體外定向分化為胰島β細胞的誘導方法與技術體系。
　　1.采用紅細胞裂解液法分離獲取兔骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)，基于其貼附塑料基質細胞培養(yǎng)板生長的特性體外擴增培

3、養(yǎng)。通過觀察形態(tài)學，鑒定細胞表面標志，描繪生長曲線等了解兔BM-MSCs生物學特性。紅細胞裂解液法操作簡便、便于復制，能夠分離獲得高純度的兔BM-MSCs，細胞生物學特性穩(wěn)定，增殖活性好。
　　2.選取P1，P3，P9代細胞進行凍存復蘇，臺盼藍染色檢測細胞復蘇率，觀察凍存時間(15d，30d，90d)對各代（P1，P3，P9代）細胞復蘇效果的影響;鑒定凍存細胞的增殖及生物學特性，向脂肪細胞誘導分化驗證其干細胞多潛能分化特性。結果表

4、明凍存復蘇的兔BM-MSCs可繼續(xù)培養(yǎng)傳代，但其傳代次數(shù)有限;仍然具有多潛能干細胞特性，可以分化為脂肪細胞。凍存的兔BM-MSCs生物學性狀相對穩(wěn)定，同樣可以應用于組織工程、細胞移植和基因治療等方面，為解決BM-MSCs的儲備、節(jié)省材料和時間提供依據(jù)。
　　3.本試驗試圖利用DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza-dC)，探討甲基化程度降低是否可以增強胰島特異基因PDX-1的表達，進而促進胰島細胞分化和β細胞的成熟。利用MTT法篩選出適

5、于誘導分化、且生長損害作用相對小的DMSO濃度。結合實驗室先前篩選出5-Aza-dc適宜作用濃度為1μmol/L，DMSO聯(lián)合高糖誘導兔BM-MSCs分化為胰島素分泌細胞的研究基礎;向不同誘導階段分別再加入5-Aza-dc聯(lián)合誘導后進行形態(tài)學對比，雙硫腙染色結果表明分化細胞均可產(chǎn)生胰島素，但是未檢測到胰島特異性基因PDX-1的表達;試驗未達到預期目的。表明，誘導方案仍需優(yōu)化。
　　4.本試驗旨在優(yōu)化、建立兔BM-MSCs體外分化為

6、胰島β細胞的高效誘導技術體系，為細胞替代治療糖尿病提供足夠細胞來源、并為后續(xù)研究奠定部分理論基礎。利用堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、B27、肝細胞生長因子、β細胞調節(jié)素、活化素A、尼克酰胺聯(lián)合高糖體外誘導兔BM-MSCs定向分化。觀察細胞形態(tài)學變化，雙硫腙特異性染色;免疫熒光染色技術檢測分化細胞內PDX-1，Insulin蛋白表達情況;RT-PCR檢測與胰島β細胞分化、內分泌功能相關基因(PDX-1，Insulin)的轉錄表達;