EDAG對(duì)人原代CD34+細(xì)胞增殖分化特性影響的研究.pdf

1、紅系分化相關(guān)基因(Erythroid Differentiation Associated Gene,EDAG)是利用代表性差異顯示技術(shù),自人胎肝中克隆分離出的新基因。EDAG特異表達(dá)于不同發(fā)育時(shí)期的造血組織,高表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞以及紅系前體細(xì)胞,在成熟血液細(xì)胞中不表達(dá)。EDAG促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖、抑制凋亡,并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化,對(duì)造血干細(xì)胞的譜系分化平衡起重要作用。EDAG與紅系分化重要的轉(zhuǎn)錄因子GATA1存在正反饋調(diào)控機(jī)制,能上調(diào)G

2、ATA1表達(dá),促進(jìn)GATA1下游紅系相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而使細(xì)胞出現(xiàn)紅系表型。但前期研究主要集中在體外細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,EDAG對(duì)人原代造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)的增殖、分化以及造血重建能力的影響尚未明確。本論文以富含造血干/祖細(xì)胞的健康產(chǎn)婦臍帶血CD34+細(xì)胞為研究對(duì)象,研究EDAG對(duì)造血干細(xì)胞增殖、分化及存活能力的影響。
　　第一,EDAG促進(jìn)CD34+細(xì)胞在體外向紅系分化。

3、首先檢測(cè)EDAG在骨髓造血干/祖細(xì)胞不同亞群中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與造血干細(xì)胞(HSC)相比,EDAG在髓系祖細(xì)胞(CMP)、紅系-巨核系祖細(xì)胞(MEP)中高度富集,而在淋巴系祖細(xì)胞(CLP)中則表達(dá)極低;進(jìn)一步檢測(cè)EDAG在紅系分化過(guò)程中的表達(dá)變化情況,發(fā)現(xiàn)在CD34+細(xì)胞經(jīng)半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)而得的BFU-E、CFU-E中以及CD34+細(xì)胞在液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)紅系分化過(guò)程中,EDAG表達(dá)均顯著上調(diào),提示EDAG在HSC紅系分化過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用。

4、為進(jìn)一步檢測(cè)EDAG在紅系分化中的作用,構(gòu)建了過(guò)表達(dá)EDAG的慢病毒載體以及針對(duì)EDAG的RNAi慢病毒載體,并分別包裝成慢病毒顆粒;經(jīng)檢測(cè),慢病毒對(duì)人原代臍血CD34+細(xì)胞具有較高的感染效率(40％以上)。過(guò)表達(dá)EDAG可促進(jìn)CD34+細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中向紅系分化,表現(xiàn)為CD71+GPA+雙陽(yáng)性細(xì)胞,特別是CD71+GPAint細(xì)胞比例增高,聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞增多。在半固體培養(yǎng)體系下,過(guò)表達(dá)EDAG的CD34+細(xì)胞形成總集落(CFC)

5、數(shù)量增多,其中紅系集落BFU-E比例增高;收取細(xì)胞進(jìn)行二次接種,BFU-E比例進(jìn)一步增高。同時(shí),在過(guò)表達(dá)EDAG的細(xì)胞集落中,GATA1及其下游紅系相關(guān)靶基因表達(dá)上調(diào)。另一方面,敲低EDAG降低CD71+GPA+細(xì)胞以及聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞比例;在半固體培養(yǎng)條件下,敲低EDAG后CD34+細(xì)胞集落形成能力降低,BFU-E比例下降。敲低EDAG后GATA1及其下游紅系相關(guān)靶基因表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)EDAG促進(jìn)紅系分化的機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)缺失與

6、GATA1相互作用的N端或缺失與p300相互作用的C端,EDAG均喪失促進(jìn)紅系分化的活性,表明EDAG促進(jìn)紅系分化依賴(lài)于EDAG/GATA1/p300復(fù)合體的形成。同時(shí),在紅系誘導(dǎo)過(guò)程中加入p300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性特異抑制劑C646,流式分析及聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)均表明EDAG促進(jìn)紅系分化的功能喪失,表明p300酶活性在EDAG發(fā)揮促紅系分化功能中起關(guān)鍵作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在紅系分化過(guò)程中,過(guò)表達(dá)EDAG促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖,并抑制由于撤除EPO誘

7、導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;敲低EDAG后CD34+細(xì)胞增殖減緩,撤除EPO后細(xì)胞凋亡增加。進(jìn)一步利用基因芯片分析在CD34+細(xì)胞向紅系分化過(guò)程中,敲低EDAG后基因表達(dá)譜變化,并與GATA1的靶基因進(jìn)行比對(duì)。發(fā)現(xiàn)EDAG正調(diào)控GATA1轉(zhuǎn)錄激活的紅系靶基因,而對(duì)GATA1轉(zhuǎn)錄抑制的靶基因沒(méi)有影響或存在正調(diào)控作用,提示EDAG對(duì)GATA1的靶基因存在選擇性調(diào)控機(jī)制;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)EDAG還調(diào)控了大量并不被GATA1調(diào)控的基因群,提示EDAG對(duì)紅系分化

8、的調(diào)控可能還存在新的未知機(jī)制。
　　第二,利用HSC移植模型證實(shí)在體內(nèi)EDAG促進(jìn)CD34+細(xì)胞向紅系發(fā)育。首先在受體小鼠品系、照射條件以及用于移植的細(xì)胞處理三個(gè)方面對(duì)造血干細(xì)胞移植模型的建立進(jìn)行條件優(yōu)化。最終確定,利用NOD/SCID/IL2γnull小鼠作為受體;移植前接受兩次、共2.5Gy劑量的X射線照射;利用新鮮分離的臍血CD34+細(xì)胞,不經(jīng)過(guò)凍融,并在分離后72小時(shí)內(nèi)完成2次慢病毒感染以及移植,能達(dá)到較高的嵌合率,并能檢

9、測(cè)到向紅系發(fā)育的細(xì)胞。利用構(gòu)建的造血干細(xì)胞移植模型,在臍血CD34+細(xì)胞過(guò)表達(dá)EDAG后經(jīng)尾靜脈注射移植入受照受體小鼠,并在移植后第4周檢測(cè)細(xì)胞發(fā)育情況。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比過(guò)表達(dá)EDAG后CD71+GPA+細(xì)胞比例增高,表明過(guò)表達(dá)EDAG促進(jìn)細(xì)胞向紅系發(fā)育,與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)EDAG后CD34+細(xì)胞比例及CD11b+細(xì)胞比例均有所增高,提示EDAG可能還參與了HSC的自我更新及定向分化的調(diào)節(jié)。
　　第三,體外擴(kuò)增

10、培養(yǎng)過(guò)程中EDAG促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖、抑制凋亡,并且維持細(xì)胞處于細(xì)胞周期。在擴(kuò)增培養(yǎng)條件下,過(guò)表達(dá)EDAG提高CD11b+比例,對(duì)其他譜系表面標(biāo)志無(wú)明顯影響,表明在體外過(guò)表達(dá)EDAG促進(jìn)細(xì)胞向髓系分化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)EDAG后CD34+細(xì)胞比例下降緩慢,提示過(guò)表達(dá)EDAG有助于造血干細(xì)胞特性的維持,這與體內(nèi)結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)EDAG促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖,并抑制撤除細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;相應(yīng)地,敲低EDAG后CD34+

11、細(xì)胞增殖緩慢,撤除細(xì)胞因子后凋亡增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)EDAG維持CD34+細(xì)胞處于細(xì)胞周期:過(guò)表達(dá)EDAG后處于G0期細(xì)胞減少,進(jìn)入細(xì)胞周期(G1/S/G2/M)的細(xì)胞增多。相應(yīng)地,敲低EDAG則使G0期細(xì)胞比例增加,進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞減少。這些結(jié)果表明EDAG促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖,提高細(xì)胞存活能力,并調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　綜上,本研究利用體外、體內(nèi)模型證實(shí)EDAG是一種新的紅系分化正調(diào)控因子,可通過(guò)與GATA1/p300形成