包埋的臍血CD34+細(xì)胞與仿生壁龕的動(dòng)態(tài)共培養(yǎng).pdf

1、臍帶血(Umbilical cord blood，UCB)，由于富含造血干/祖細(xì)胞(Hematopoieticstem/progenitor cells，HSPCs)、具有良好的移植優(yōu)勢(shì)，被視為治療人類疾病的寶貴生物資源，目前已應(yīng)用于治療惡性血液病、實(shí)體瘤、遺傳性疾病等。然而，單份臍帶血中HSPCs含量過(guò)低，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，在體外利用工程化的手段擴(kuò)增臍帶血中的HSPCs，成為了解決該問(wèn)題的重要途徑。目前，傳統(tǒng)的體外擴(kuò)增方法

2、主要存在兩方面問(wèn)題:1）造血干細(xì)胞易過(guò)早分化，失去干性;2）擴(kuò)增的目的細(xì)胞易引入異體細(xì)胞或異源因子，導(dǎo)致移植的失敗。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)的骨髓微環(huán)境，可以使HSPCs永久的維持自我更新?；诖?，本文將首先構(gòu)建仿生成骨細(xì)胞壁龕，為HSPCs提供間接的支持;其次，制備性能優(yōu)異的膠珠作為HSPCs的包埋基質(zhì)，隔離異體細(xì)胞或大分子;最后，在動(dòng)態(tài)條件下，利用仿生壁龕擴(kuò)增包埋的臍血CD34+細(xì)胞，以期實(shí)現(xiàn)CD34+細(xì)胞的高效擴(kuò)增。
　　仿生成骨細(xì)胞

3、壁龕的構(gòu)建:首先，通過(guò)冷凍干燥和化學(xué)交聯(lián)法，制備了不同比例的載HAp-CS/Gel支架。其次，通過(guò)掃描電鏡觀察支架的形貌，發(fā)現(xiàn)HAp的摻入并不改變支架的形貌，支架孔徑為135-150μm，具有良好的貫通性;通過(guò)測(cè)定孔隙率、吸水率、接觸角等，確定了HAp摻入比例為100∶20時(shí)，復(fù)合支架具有優(yōu)異的性能:孔隙率大于90％，吸水率為19.1，接觸角由88.5°變?yōu)?5.8°，支架的表面親水性增加。同時(shí)，通過(guò)能譜分析和紅外光譜分析得出，支架中的

4、組成成分間會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，HAp以團(tuán)聚體或顆粒的形式，均勻分布在支架的孔壁上，為成骨細(xì)胞提供足夠多的生長(zhǎng)位點(diǎn)。最后，將成骨細(xì)胞接種在性能最優(yōu)的復(fù)合支架上，構(gòu)建仿生壁龕，通過(guò)熒光染色和SEM觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可均勻分布于支架表面，并具有良好的活性;通過(guò)MTT測(cè)試和堿性磷酸酶檢測(cè)得出，成骨細(xì)胞可以在復(fù)合支架中維持良好的功能。
　　CAG細(xì)胞包埋基質(zhì)的制備:首先，通過(guò)簡(jiǎn)單的液滴法制備了具有“核殼”結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣/明膠(Calcium alg

5、inate/gelatin，CAG)膠珠，膠珠內(nèi)部分布著網(wǎng)狀的孔道，寬度約為18μm。其次，通過(guò)機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試和擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)得出，膠珠在兩周的動(dòng)態(tài)攪拌下可以維持一定的強(qiáng)度，且具有一定的半透性能，可阻止大分子蛋白的通過(guò)。最后，通過(guò)成骨細(xì)胞的包埋實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了膠珠具有較優(yōu)的生物相容性，適宜作為細(xì)胞包埋基質(zhì)。
　　包埋的臍血CD34+細(xì)胞與仿生壁龕的動(dòng)態(tài)共培養(yǎng):首先，采用免疫磁珠法，從臍帶血中逐步分離出CD34+細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)、流式分析得到，C

6、D34+細(xì)胞活率較高約為93.2％，CD34陽(yáng)性表達(dá)比例為90.24％，可作為培養(yǎng)的起始細(xì)胞。其次，用CAG膠珠包埋CD34+細(xì)胞，在動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)瓶中與仿生成骨細(xì)胞壁龕進(jìn)行共培養(yǎng)，同時(shí)，設(shè)置兩個(gè)靜態(tài)的對(duì)照組，來(lái)研究動(dòng)態(tài)環(huán)境和仿生壁龕對(duì)CD34+細(xì)胞的作用。通過(guò)計(jì)算包埋收獲的CD34+細(xì)胞的增殖倍數(shù)、活率得出，第10天時(shí)，動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)條件下，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增24.2±2.3倍，并且可以維持84.1％的活率，而兩個(gè)靜態(tài)組中，特別是無(wú)仿生壁龕支持的

7、情況下，細(xì)胞擴(kuò)增緩慢，且只有約50％的活率。通過(guò)流式測(cè)定CD34表達(dá)率、集落形成單元計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)在三組實(shí)驗(yàn)中，CD34的表達(dá)率都會(huì)下降，但動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)組下降最慢，在10天時(shí)，CD34仍可維持80.3％的表達(dá)率;同時(shí)，動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的集落形成單元有明顯的擴(kuò)增，在第14天可以擴(kuò)增11.7±2.5倍，而在靜態(tài)組的擴(kuò)增倍數(shù)則較低。以上結(jié)果，可以充分證明動(dòng)態(tài)環(huán)境和仿生壁龕可以共同促進(jìn)臍血CD34+細(xì)胞的增殖，并維持細(xì)胞的活性和干性。
　　本文構(gòu)建