大鼠慢加急性肝衰竭模型的建立及其病理機制初步研究.pdf

1、目的:建立與人慢加急性肝衰竭病理過程、生化改變相似，實用性、重復性好的動物模型，為研究慢加急性肝衰竭發(fā)生的病理生理機制、藥物篩選及療效評價提供適宜的模型。 材料與方法:本實驗共分兩部分: 第一部分是大鼠慢加急性肝衰竭模型建立方-法的探索。 (1)用人血白蛋白免疫法建立大鼠肝硬化模型，尾靜脈注射6周后行肝活檢術明確肝纖維化程度。 (2)急性攻擊方法的篩選：雌性wistar大鼠24只隨機分為四組，每組6只，組

2、一給予1.2g/kg的D一氨基半乳糖腹腔注射；組'30mg/kg脂多糖尾靜脈注射；組三給卡介苗2.0×10<'8>個減毒活菌苗尾靜脈注射后8天給50μg/kg脂多糖尾靜脈注射：組四給D-氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖100μg/Kg同時腹腔注射；觀察每組動物生存時間、組織病理及肝臟損害器官特異性。 (3)肝硬化大鼠給于不同急性攻擊方法的實驗研究。成模肝硬化大鼠22只，于肝活檢5天后隨機分組，組一(n=6)給予1.2g/kg的

3、D-氨基半乳糖腹腔注射：組二(n=6)給予30mg/kg脂多糖尾靜脈注射；組三(n=6)給D一氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖100μg/Kg同時腹腔注射，計算每組動物生存時間、觀察組織病理的變化。 第二部分是大鼠慢加急性肝衰竭與急性肝衰竭不同病理機制的初步研究。 免疫誘導型肝硬化大鼠65只及正常大鼠50只，同期給予D-氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖100μg/Kg腹腔注射后分別出現(xiàn)慢加急性肝衰竭及急性肝衰竭，分別

4、于給藥后0、4、8、12小時分批采血處死，動態(tài)觀察肝功能、血漿TNF-α、IL-10及肝組織病理變化，并以TUNEL法檢測原位細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)。RT-PCR方法檢測各時間點肝組織中內(nèi)毒素受體TLR4mRNA的表達。同時觀察每組動物的死亡率及生存時間。 結果: (1)白蛋白攻擊6周后大多數(shù)動物可形成4級或以上肝纖維化。單純給予D-氨基半乳糖組及D-氨基半乳糖+脂多糖組大鼠均發(fā)生肝臟大塊壞死；卡介苗+脂多糖大鼠肝、脾、

5、肺均間肉芽腫樣結構，肝臟損傷器官特異性不佳；脂多糖組大鼠肝臟表現(xiàn)為Kupffer細胞激活，肝細胞壞死性病變不明顯，肺臟及腎臟均有不同程度病變。 肝硬化大鼠給與1.2g/kg的D-氨基半乳糖后，5只大鼠在39～52小時之內(nèi)死亡，肝組織病理顯示肝硬化基礎上發(fā)生彌漫大小泡脂肪變性，僅見小片壞死灶；6只肝硬化大鼠給與30mg/kg脂多糖后均存活良好，3天后處死肝組織未見壞死性病變。肝硬化大鼠給予D-氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖10

6、0tJg/Kg同時腹腔注射后，5只大鼠在13～19小時內(nèi)死亡，肝臟病理表現(xiàn)為再生結節(jié)大塊或亞大塊壞死，肝細胞凋亡明顯。 (2)肝硬化與正常大鼠在遭受同劑量D-Gal/LPS急性打擊后，分別有88.0﹪及58.3﹪的大鼠死于急性肝衰竭，平均生存時間分別為16.1±3.7h和15.6±1.8h，ACLF組死亡率高于AHF(P=0.028)。光鏡下觀察兩組動物肝細胞壞死范圍隨時間進展程度相似，而電鏡下觀察ACLF組肝細胞凋亡重，TUN

7、EL分析結果提示ACLF組大鼠給藥后4、8、12小時肝細胞凋亡指數(shù)均高于AHF組同時間點。ACLF組大鼠血漿TNF-α峰值低于AHF組大鼠(P=0.001)并且所達峰值時間延遲，兩組動物血漿IL-10水平均隨時間延長而升高，給藥后8小時ACLF組大鼠IL-10水平高于AHF組(P=0.01)。兩組肝衰竭大鼠給藥后肝組織TLR4mRNA表達均增強并與血漿TNF-α含量呈正相關。 結論: (1)對免疫誘導型肝硬化或肝纖維化大

8、鼠給予D-氨基半乳糖/脂多糖聯(lián)合急性攻擊可建立慢加急性肝衰竭模型，而單獨給大劑量D-氨基半乳糖或脂多糖不能使肝硬化大鼠發(fā)生肝臟大塊或亞大塊壞死。 (2)肝硬化及正常大鼠給與同劑量D-氨基半乳糖/脂多糖急性攻擊后，前者死亡率高于后者，ACLF組大鼠肝細胞凋亡重于AHF組可能與其高死亡率有關。 (3)兩組肝衰竭大鼠炎癥因子的水平不同，提示慢加急性肝衰竭大鼠單核吞噬系統(tǒng)功能下降。 (4)TLR4參與了慢加急性肝衰竭的發(fā)