大鼠慢加急性肝衰竭模型的建立及其病理機(jī)制初步研究.pdf

1、目的:建立與人慢加急性肝衰竭病理過(guò)程、生化改變相似，實(shí)用性、重復(fù)性好的動(dòng)物模型，為研究慢加急性肝衰竭發(fā)生的病理生理機(jī)制、藥物篩選及療效評(píng)價(jià)提供適宜的模型。 材料與方法:本實(shí)驗(yàn)共分兩部分: 第一部分是大鼠慢加急性肝衰竭模型建立方-法的探索。 (1)用人血白蛋白免疫法建立大鼠肝硬化模型，尾靜脈注射6周后行肝活檢術(shù)明確肝纖維化程度。 (2)急性攻擊方法的篩選：雌性wistar大鼠24只隨機(jī)分為四組，每組6只，組

2、一給予1.2g/kg的D一氨基半乳糖腹腔注射；組'30mg/kg脂多糖尾靜脈注射；組三給卡介苗2.0×10<'8>個(gè)減毒活菌苗尾靜脈注射后8天給50μg/kg脂多糖尾靜脈注射：組四給D-氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖100μg/Kg同時(shí)腹腔注射；觀察每組動(dòng)物生存時(shí)間、組織病理及肝臟損害器官特異性。 (3)肝硬化大鼠給于不同急性攻擊方法的實(shí)驗(yàn)研究。成模肝硬化大鼠22只，于肝活檢5天后隨機(jī)分組，組一(n=6)給予1.2g/kg的

3、D-氨基半乳糖腹腔注射：組二(n=6)給予30mg/kg脂多糖尾靜脈注射；組三(n=6)給D一氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖100μg/Kg同時(shí)腹腔注射，計(jì)算每組動(dòng)物生存時(shí)間、觀察組織病理的變化。 第二部分是大鼠慢加急性肝衰竭與急性肝衰竭不同病理機(jī)制的初步研究。 免疫誘導(dǎo)型肝硬化大鼠65只及正常大鼠50只，同期給予D-氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖100μg/Kg腹腔注射后分別出現(xiàn)慢加急性肝衰竭及急性肝衰竭，分別

4、于給藥后0、4、8、12小時(shí)分批采血處死，動(dòng)態(tài)觀察肝功能、血漿TNF-α、IL-10及肝組織病理變化，并以TUNEL法檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)。RT-PCR方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝組織中內(nèi)毒素受體TLR4mRNA的表達(dá)。同時(shí)觀察每組動(dòng)物的死亡率及生存時(shí)間。 結(jié)果: (1)白蛋白攻擊6周后大多數(shù)動(dòng)物可形成4級(jí)或以上肝纖維化。單純給予D-氨基半乳糖組及D-氨基半乳糖+脂多糖組大鼠均發(fā)生肝臟大塊壞死；卡介苗+脂多糖大鼠肝、脾、

5、肺均間肉芽腫樣結(jié)構(gòu)，肝臟損傷器官特異性不佳；脂多糖組大鼠肝臟表現(xiàn)為Kupffer細(xì)胞激活，肝細(xì)胞壞死性病變不明顯，肺臟及腎臟均有不同程度病變。 肝硬化大鼠給與1.2g/kg的D-氨基半乳糖后，5只大鼠在39～52小時(shí)之內(nèi)死亡，肝組織病理顯示肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生彌漫大小泡脂肪變性，僅見(jiàn)小片壞死灶；6只肝硬化大鼠給與30mg/kg脂多糖后均存活良好，3天后處死肝組織未見(jiàn)壞死性病變。肝硬化大鼠給予D-氨基半乳糖400mg/kg+脂多糖10

6、0tJg/Kg同時(shí)腹腔注射后，5只大鼠在13～19小時(shí)內(nèi)死亡，肝臟病理表現(xiàn)為再生結(jié)節(jié)大塊或亞大塊壞死，肝細(xì)胞凋亡明顯。 (2)肝硬化與正常大鼠在遭受同劑量D-Gal/LPS急性打擊后，分別有88.0﹪及58.3﹪的大鼠死于急性肝衰竭，平均生存時(shí)間分別為16.1±3.7h和15.6±1.8h，ACLF組死亡率高于AHF(P=0.028)。光鏡下觀察兩組動(dòng)物肝細(xì)胞壞死范圍隨時(shí)間進(jìn)展程度相似，而電鏡下觀察ACLF組肝細(xì)胞凋亡重，TUN

7、EL分析結(jié)果提示ACLF組大鼠給藥后4、8、12小時(shí)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于AHF組同時(shí)間點(diǎn)。ACLF組大鼠血漿TNF-α峰值低于AHF組大鼠(P=0.001)并且所達(dá)峰值時(shí)間延遲，兩組動(dòng)物血漿IL-10水平均隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，給藥后8小時(shí)ACLF組大鼠IL-10水平高于AHF組(P=0.01)。兩組肝衰竭大鼠給藥后肝組織TLR4mRNA表達(dá)均增強(qiáng)并與血漿TNF-α含量呈正相關(guān)。 結(jié)論: (1)對(duì)免疫誘導(dǎo)型肝硬化或肝纖維化大

8、鼠給予D-氨基半乳糖/脂多糖聯(lián)合急性攻擊可建立慢加急性肝衰竭模型，而單獨(dú)給大劑量D-氨基半乳糖或脂多糖不能使肝硬化大鼠發(fā)生肝臟大塊或亞大塊壞死。 (2)肝硬化及正常大鼠給與同劑量D-氨基半乳糖/脂多糖急性攻擊后，前者死亡率高于后者，ACLF組大鼠肝細(xì)胞凋亡重于AHF組可能與其高死亡率有關(guān)。 (3)兩組肝衰竭大鼠炎癥因子的水平不同，提示慢加急性肝衰竭大鼠單核吞噬系統(tǒng)功能下降。 (4)TLR4參與了慢加急性肝衰竭的發(fā)