慢加急性肝衰竭患者中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成及其影響因素.pdf

1、目的：
　　觀察慢加急性肝衰竭患者在體中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成;觀察慢加急性肝衰竭患者在體中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成的影響因素。
　　方法：
　　根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)相關(guān)指南建議，將入組患者分為慢性肝炎組(Chronic Hepatitis B，CHB)、肝硬化組(Cirrhosis，CIR)和慢加急性肝衰竭組(Acute-on-chronic Liver Failure，ACLF)。收集血常規(guī)、肝功能檢查和凝血功能檢查結(jié)果以及

2、病人預(yù)后等相關(guān)臨床資料，并用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linkedImmunosorbent，ELISA)試劑盒檢測血漿標(biāo)本NETs相關(guān)標(biāo)志物髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(PolymorphonuclearElastase，PMNE)水平。對比不同肝病進(jìn)程患者在體NETs形成程度以及離體中性粒細(xì)胞NETs形成能力的差異，評(píng)估血漿NETs相關(guān)標(biāo)志物對患者預(yù)后的價(jià)值。
　　通過激活或抑

3、制5-HT受體(5-HT Receptor，HTR)判定參與此過程的受體。最后通過熒光定量、免疫印跡法和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察5-HT對NETs形成重要環(huán)節(jié)的影響。
　　結(jié)果：
　　一、慢加急性肝衰竭患者在體NETs形成
　　因此我們進(jìn)一步將肝硬化和慢加急性肝衰竭兩組患者（本文歸類為終末期肝?。┲泄缺D(zhuǎn)氨酶(Alanine Transaminase，ALT)≥200IU/L的患者(N=37)根據(jù)其30天預(yù)后分為生存組和

4、死亡組，結(jié)果顯示:生存組血漿PMNE水平(log10pg/ml)低于死亡組(4.941[4.4-6.16] vs.5.044[4.58-5.61]，P=0.0205)，血漿PMNE水平對預(yù)測患者30天預(yù)后有一定的準(zhǔn)確性(AUC=0.7243，P=0.0216)。此外，這部分患者血漿PMNE水平與總膽紅素(Total Bilirubin，TBIL)存在正相關(guān)(R。=0.3912，P=0.0167)，與其他肝功能指標(biāo)如ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

5、(AspartateTransaminase，AST)和白蛋白(Albumin，ALB)無明顯相關(guān)性(P＞0.05);與凝血酶原時(shí)間(Prothrombin Time，PT，Rs=0.3707，P=0.0167)、凝血酶時(shí)間(Thrombin Time，TT，Rs=0.4002，P=0.0386)、凝血酶原標(biāo)準(zhǔn)化比率(Prothrombin Time International Standard Ratio，PT-INR，Rs=0.37

6、18，P=0.0235)和活化部分凝血活酶時(shí)間(Actived Partial Thromboplastin Time，APTT，Rs=0.2715，P=0.0055)存在正相關(guān)，與凝血酶原活動(dòng)度(Prothrombin Activity，PTA)負(fù)相關(guān)(Rs=-0.3312，P=0.0452)，但與纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)IB)無明顯相關(guān)性(Rs=0.0145，P=0.8955)。
　　二、慢加急性肝衰竭患者在體中性

7、粒細(xì)胞外網(wǎng)形成的影響因素
　　活化血小板釋放多種生物活性物質(zhì)，其中血清素(5-HT)為血小板中含量最豐富的生物活性物質(zhì)之一。加入100μM5-HT可明顯抑制PMA誘導(dǎo)下NADPH氧化酶依賴途徑NETosis(P=0.0002)，并呈濃度依賴性。5-HT不能抑制Ionomycin誘導(dǎo)的非NADPH氧化酶依賴途徑中性粒細(xì)胞死亡，但明顯抑制Spread NETs形成。
　　但加入PMA和Ionomycin刺激慢乙肝、肝硬化和慢加急

8、性肝衰竭三組患者離體中性粒細(xì)胞，結(jié)果顯示:在PMA刺激180分鐘，慢加急性肝衰竭患者離體中性粒細(xì)胞死亡少于慢乙肝患者(144[100.4-178.9]％ Control vs.315[178-428]％ Control，P=0.0043);與肝硬化患者比較差異無顯著性(144[100.4-178.9]％ Control vs.271[131.1-620.4]％ Control，P=0.1320);鏡下觀察慢加急性肝衰竭患者離體中性粒細(xì)胞

9、NETs形成減少。慢乙肝、肝硬化和慢加急性肝衰竭三組患者離體中性粒細(xì)胞在Ionomycin誘導(dǎo)下NETs形成水平差異無顯著性(CHB vs.ACLF:238.3[144-369.6]％ Control vs.185[131.5-313]％Control，P=0.1797; CIR vs.ACLF:191.7[119.3-434]％ Control vs.185[131.5-313]％Control，P=0.5714)。
　　三、血

10、清素對中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成的影響
　　5-HT的作用受體5-HT受體(HTR)包括1-7型，通過激活或阻斷不同HTR，我們發(fā)現(xiàn)抑制HTR2b(P=0.0108)或激活HTR2b(P=0.0177)可調(diào)節(jié)5-HT對NETs形成的影響，但無法檢測到HTR2b mRNA的表達(dá)。5-HT抑制NADPH氧化酶依賴途徑NETs形成重要環(huán)節(jié)中的ROS形成（60分鐘:P=0.0054;120分鐘:P＜0.0001;180分鐘:P＜0.0001）和P

11、MNE核轉(zhuǎn)位，但無法抑制組蛋白H3瓜氨酸化和自噬發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　一、慢加急性肝衰竭患者在體中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成
　　肝衰竭患者體內(nèi)存在的多種損傷相關(guān)分子模式(Damage AssociatedMolecular Patterns，DAMPs)，可被機(jī)體識(shí)別為危險(xiǎn)信號(hào)，刺激固有免疫反應(yīng)活化，其中包括促進(jìn)中性粒細(xì)胞在炎癥部位聚集并形成NETs。理論上肝衰竭患者在體NETs形成應(yīng)增加，但臨床數(shù)據(jù)分析提示總體慢加急性肝衰

12、竭患者NETs水平并不比慢性乙肝或肝硬化患者更高，而進(jìn)展期慢加急性肝衰竭患者在體NETs形成較高，可能與入組慢加急性肝衰竭組中部分患者處于穩(wěn)定期或恢復(fù)期，其自身抗炎反應(yīng)的良性代償性增強(qiáng)有關(guān)，此時(shí)患者在體NETs形成較低或無。
　　二、慢加急性肝衰竭患者在體中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成的影響因素
　　小鼠實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道支持肝損傷誘導(dǎo)肝內(nèi)NETs形成，但慢加急性肝衰竭患者LPS刺激前后中性粒細(xì)胞-血小板結(jié)合體水平與對照組無顯著差異，我們猜

13、測血小板釋放的某種物質(zhì)促進(jìn)NETs形成。
　　血小板活化釋放多種生物活性物質(zhì)，5-HT為其中含量較為豐富的物質(zhì)之一。出乎意料，我們發(fā)現(xiàn)5-HT抑制PMA誘導(dǎo)的NADPH氧化酶依賴途徑和Ionomycin誘導(dǎo)的非NADPH氧化酶依賴途徑典型NETs形成。此外，機(jī)體95％血清素儲(chǔ)存于血小板中，我們發(fā)現(xiàn)慢加急性肝衰竭患者血漿和ADP刺激后5-HT釋放量低于慢乙肝患者。
　　5-HT可抑制NETs形成，但慢加急性肝衰竭患者血小板水平

14、降低，以及血漿和血小板內(nèi)5-HT水平降低，這可能是慢加急性肝衰竭患者進(jìn)展期NETs形成的促進(jìn)因素之一。
　　但在體外實(shí)驗(yàn)中，分離不同肝病進(jìn)程患者外周血中性粒細(xì)胞并加入PMA和Ionomycin刺激，在PMA刺激180分鐘后慢加急性肝衰竭患者的離體中性粒細(xì)胞NETs形成明顯少于慢乙肝患者，提示慢加急性肝衰竭患者中性粒細(xì)胞在體NETs形成能力的受損。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道肝硬化和急性肝損傷患者中性粒細(xì)胞功能受損具有一致性。
　　以上結(jié)果

15、提示慢加急性肝衰竭患者NETs形成調(diào)控因素復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。
　　三、血清素對中性粒細(xì)胞外網(wǎng)形成的影響
　　接下來我們主要關(guān)注了5-HT對NETs形成的影響。我們發(fā)現(xiàn)5-HT可能通過作用于HTR2b而調(diào)控NETs形成，但無法檢測到HTR2b的mRNA表達(dá)，考慮可能原因?yàn)橹行粤＜?xì)胞HTR2b的轉(zhuǎn)錄水平不活躍，下一步需檢測中性粒細(xì)胞上HTR2b的蛋白水平。
　　ROS產(chǎn)生、自噬發(fā)生、PMNE核轉(zhuǎn)位、組蛋白H3瓜氨酸化、

16、鈣離子內(nèi)流和組蛋白H1、H4的降解為NADPH氧化酶依賴途徑NETs形成的重要環(huán)節(jié)，目前可以確定的是5-HT影響其中ROS形成和PMNE核轉(zhuǎn)位，但不能抑制組蛋白H3瓜氨酸化。對自噬發(fā)生、鈣離子內(nèi)流和組蛋白H1、H4降解的影響需要進(jìn)一步確認(rèn)。
　　綜上推測，在肝竇內(nèi)，血小板激活并和中性粒細(xì)胞結(jié)合，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞ROS生成和PMNE核轉(zhuǎn)位，NETs形成;血小板聚集粘附與NETs上，其活化后釋放多種生物活性物質(zhì)，5-HT水平升高;局部高