雞傳染性喉氣管炎病毒HN1株gB基因核酸疫苗的構(gòu)建與雞IL-18聯(lián)合免疫效力觀察.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎(ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起雞的一種急性、高度接觸性上呼吸道傳染病，呈全球性流行，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。目前國(guó)內(nèi)外防制本病普遍采用弱毒疫苗。這些疫苗的毒力普遍偏強(qiáng)，可以在雞體內(nèi)潛伏感染，而且在雞體傳代過(guò)程中毒力返強(qiáng)。因此，研制更安全而有效的疫苗，將有利于徹底控制乃至根除ILT。DNA疫苗作為第3代疫苗，因其既有亞單位疫苗的安全性，又有減毒活疫苗的有效性而受到研究人員的矚目。但是DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)

2、體產(chǎn)生的抗體水平低，還不能完全有效抵抗致死劑量病原體的攻擊，因此，本研究采用PCR技術(shù)從河南省分離的ILTV HN1株DNA中擴(kuò)增gB基因，構(gòu)建gB基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其與雞IL-18基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫SPF雞，探索ILLTV HN1株gB基因的免疫原性以及雞IL-18的免疫增強(qiáng)作用，以期為更好地防制ILT提供新的思路。研究?jī)?nèi)容如下： 1.根據(jù)已發(fā)表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列(M64927)設(shè)計(jì)、合成了

3、1對(duì)引物，以ILTV HN1株基因組DNA為模板，從河南省分離的ILTV HN1株DNA中擴(kuò)增gB基因，并進(jìn)行克隆和測(cè)序。結(jié)果表明，獲得了ILTV HN1株gB基，全長(zhǎng)為2629 bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框，共編碼873個(gè)氨基酸的多肽，推導(dǎo)氨基酸序列有8個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，有12個(gè)與二硫鍵形成有關(guān)的半胱氨酸。序列分析表明，ILTV HN1株gB基因與GenBank中讀取的澳大利亞SA2疫苗株、遼寧疫苗株、煙臺(tái)株、美國(guó)632強(qiáng)毒株

4、、英國(guó)Throne強(qiáng)毒株gB基因核苷酸序列同源性為99％以上，與ILTV-SA2株gB基因比較發(fā)現(xiàn)，ILTV HNl株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1個(gè)堿基G，而在第102位又都插入1個(gè)堿基A，從而引起該毒株gB基因推導(dǎo)的氨基酸序列中第28～32位5個(gè)氨基酸的移碼突變。 2.根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和ILTV gB全基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)，合成1對(duì)引物，PCR擴(kuò)增ILTV gB全基因。將EcoR I和Xho I酶

5、切獲得的gB基-因片段克隆到經(jīng)同樣處理的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/gB(簡(jiǎn)稱pgB)。將pgB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，RT-PCR表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞中含gB基因的mRNA，間接免疫熒光檢測(cè)表明目的蛋白在CEF中得到了表達(dá)。 3.通過(guò)RT-PCR技術(shù)，無(wú)需用非特異性免疫原如ConA、PHA等刺激分離的脾淋巴細(xì)胞，直接從羅曼雞脾淋巴細(xì)胞提取的總RNA中擴(kuò)增雞IL-18全基因，并克

6、隆和測(cè)序。結(jié)果表明，雞IL-18基因全長(zhǎng)為597 bp。與GenBank中查得的雞IL-18基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，羅曼雞IL-18基因與Schneider報(bào)道的雞IL-18基因序列完全一致。將該基因片段重組到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/IL-18(簡(jiǎn)稱pIL-18)。經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切、PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序，證實(shí)雞IL-18全基因被正確重組到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒上；

7、將pIL-18質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中含雞IL-18基因的mRNA，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)雞淋巴細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用。 4.為了檢測(cè)這2個(gè)質(zhì)粒是否可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫，分別用這2個(gè)重組質(zhì)粒和載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)以及減毒疫苗免疫接種21日齡SPF雞，免疫分組：(A)pgB，(B) pIL-18，(C)pgB和pIL-18，(D)減毒疫苗和pIL-18，(E)減毒疫苗，(F)pcDNA3.1(+)，(G) Con

8、trol。免疫2次，間隔為2周，每次每只雞的免疫劑量為100μg。以MTT法檢測(cè)雞外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)絲分裂原ConA刺激后的增殖反應(yīng)活性，Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T、CD8+T和TCR+T細(xì)胞的變化及間接ELISA法檢測(cè)血清抗體水平。結(jié)果表明，ILTV gB因免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，免疫組外周血中CD4+T、CD8+T和TCR+T細(xì)胞明顯高于對(duì)照組

9、，含IL-18基因的兩組(C和D)誘導(dǎo)了高水平的IFN-γ和IL-2表達(dá)，載體質(zhì)粒和空白對(duì)照組沒有變化，血清抗體在免疫后第2周發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn)，而對(duì)照組無(wú)相應(yīng)變化。這是ILTV基因gB基-因和雞IL-18基因免疫研究的首次報(bào)道。第2次免疫后3周，所有雞以ILTVHN1株強(qiáng)毒0.4 mL進(jìn)行攻毒。攻毒后，非免疫雞全部發(fā)病，并在第2天出現(xiàn)死亡，免疫組部分發(fā)病，ILTV HN1株gB基因單獨(dú)或與雞IL-18基因聯(lián)合免疫的保護(hù)率分別為79％、86％，而