瑟氏泰勒蟲p33基因與牛IL-18基的串聯(lián)表達.pdf

1、瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）是泰勒科、泰勒屬的血液原蟲，寄生在紅細胞內(nèi)。感染泰勒蟲的牛主要表現(xiàn)為慢性貧血、高熱、消瘦和淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀，感染泰勒蟲的牛只由于貧血導致免疫力下降，極易引起其他血液性疾病的病原體的繼發(fā)感染，進而導致死亡率的升高，給養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)造成不可避免的經(jīng)濟損失。近年來，隨著中國牛養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，瑟氏泰勒蟲的發(fā)病率在全國范圍內(nèi)的各個地區(qū)呈以驚人的速度呈上升趨勢，給全國各地區(qū)的養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟威

2、脅。因此，有效控制瑟氏泰勒蟲的發(fā)病率成為當務之急。本試驗將瑟氏泰勒蟲主要表面抗原 p33基因與牛白細胞介素18(IL-18)基因進行重組表達，結(jié)果表明表達出的重組蛋白IL-18-p33具有相當好的反應原性。
　　瑟氏泰勒蟲的p33基因是瑟氏泰勒蟲的主要表面蛋白之一，能夠引起宿主的良好的特異性免疫反應。根據(jù) GenBank上已經(jīng)發(fā)表的p33基因序列[GenBank:DQ078264.1]白細胞介素18基因序列（IL-18）[GenB

3、ank: EU574909.1]分別設(shè)計兩對特異性引物。提取感染瑟氏泰勒蟲牛的陽性抗凝血液DNA，并以血液DNA為模板應用聚合酶鏈式反應技術(shù)（即PCR技術(shù)）擴增得到大小為821 bp大小左右的目的片段。提取pMD-18-T-IL-18質(zhì)粒DNA，以該質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR技術(shù)，得到大小為627 bp目的片段。應用SOE-PCR技術(shù)將兩段基因串聯(lián)，得到串聯(lián)基因IL-18-p33，大小為1416 bp。將經(jīng)SOP-PCR技術(shù)得到的串聯(lián)

4、基因片段與pMD-19-T simple載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的克隆菌種DH5α。提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA經(jīng)過PCR、BamHⅠ，XhoⅠ雙酶切和測序確定串聯(lián)基因 IL-18-p33成功與 pMD-19-T simple載體連接后，將該重組質(zhì)粒命名為pMD-19T-IL18-p33。將質(zhì)粒pMD-19T-IL18-p33和原核表達載體pGEX-4T1經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，分別回收酶切后的IL18-p33和pGEX-4T

5、1的目的條帶，然后進行16℃過夜連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達的菌株 BL21，提取質(zhì)粒 DNA后進行質(zhì)粒 PCR鑒定和 BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，并將其命名為BL21-pGEX4T1-IL18-p33。對 BL21-pGEX4T1-IL18-p33進行1/1000濃度的IPTG誘導表達。將誘導產(chǎn)物進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果在66.4 kDa與97.2 kDa之間出現(xiàn)一條79 kDa左右大小條帶，且與預期結(jié)果大小相符。