普通棉耳絨猴MHC-Ⅰ型基因多態(tài)性特征分析.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)感染人體后可以引起丙型肝炎，是造成人類肝病的一個(gè)主要原因。丙型肝炎在全世界范圍都有報(bào)道，國(guó)際衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界大約有1億8千萬(wàn)人受到了丙型肝炎病毒的感染，并以每年新增3.5萬(wàn)人的速度在增加。丙型肝炎病毒具有嚴(yán)格的種屬特異性，只有人類和黑猩猩可以被丙型肝炎病毒感染，而黑猩猩成本昂貴，加之倫理學(xué)等因素，極大的限制了丙型肝炎病毒動(dòng)物感染模型的建立。因此，人類一直處于一個(gè)缺乏丙型肝炎病毒動(dòng)物感染模型的境地，極大的限制了開

2、發(fā)新型抗病毒藥物以及疫苗的研究。雖然科學(xué)家一直致力于丙型肝炎病毒的研究，來(lái)預(yù)防和治療丙型肝炎持續(xù)感染，但是丙型肝炎病毒感染的分子機(jī)制一直沒(méi)有被明確的闡述。GB病毒-B(GBV-B)的出現(xiàn)使很多研究HCV的學(xué)者開始注重另一項(xiàng)研究，就是開發(fā)一種GBV-B感染小型靈長(zhǎng)類動(dòng)物替代模型，來(lái)模擬HCV在人類體內(nèi)感染的過(guò)程。
　　 GBV-B是一種與丙型肝炎病毒(HCV)非常相近的病毒，同屬黃病毒科肝病毒屬。這種病毒早在40年前被描述，它是將

3、處在HCV感染急性期的病人血清注射到絹毛猴體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，將這只絹毛猴血清繼續(xù)注射到另外一只健康的絹毛猴體內(nèi)，這樣經(jīng)歷了很多次傳代后，從絹毛猴體內(nèi)得到的一種可以感染絹毛猴并可以引起肝炎的RNA病毒。除了絹毛猴，GBV-B還可以感染絨科動(dòng)物中的普通棉耳絨猴。引起它們類似人類肝炎的癥狀。有一些學(xué)者還構(gòu)建了HCV/GBV-B嵌合病毒，將HCV的5'-NCR、HVR1、p7等小基因片段(＜212bp)，甚至是HCV完整結(jié)構(gòu)蛋白基因替換到G

4、BV-B中，用嵌合病毒感染普通棉耳狨猴，希望能夠更準(zhǔn)確真實(shí)地模擬HCV在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的活動(dòng)狀態(tài)。
　　 普通棉耳絨猴屬新世界小型靈長(zhǎng)類動(dòng)物，與絹毛猴同屬絨科。普通棉耳狨猴可以被GBV-B感染并產(chǎn)生類似人類肝炎的癥狀。因此，可以用來(lái)作為一種替代模型來(lái)研究丙型肝炎病毒的感染。這種小動(dòng)物具有體小(成年體重350g到400g)、繁殖率高、進(jìn)食少、費(fèi)用相對(duì)于黑猩猩低、易在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)籠養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，清楚的主要組織相容性復(fù)合體多

5、態(tài)性信息是必不可少的，尤其是Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。目前對(duì)普通棉耳狨猴的主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性信息的了解卻知之甚少。Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體具有高度的多態(tài)性，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，起到了識(shí)別病原體的功能。另外，在CD8陽(yáng)性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)中，對(duì)于病毒的清除存在著明顯的個(gè)體差異，有些個(gè)體會(huì)自然清除，而有些個(gè)體卻會(huì)持續(xù)感染，在這個(gè)現(xiàn)象中，個(gè)體之間存在著不同的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體等位基因是主要的一個(gè)

6、因素。因此，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，清晰的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性背景資料是必要的。普通棉耳狨猴的種系相對(duì)來(lái)說(shuō)比較單純，很適合用來(lái)研究主要組織相容性復(fù)合體介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。到目前為止，對(duì)于普通棉耳狨猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的等位基因的研究還很有限，只有少數(shù)幾條等位基因被發(fā)現(xiàn)。在本研究中，從9只用來(lái)研究HCV/GBV-B絨猴感染模型的普通棉耳狨猴中分離出了Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體全長(zhǎng)基因并對(duì)這些基因進(jìn)行了比對(duì)分析。
　　 首先，

7、利用TRIzol將絨猴總RNA從絨猴的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分提取出來(lái)，并妥善保存。設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)針對(duì)絨猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的引物，這兩對(duì)引物是來(lái)自文獻(xiàn)中報(bào)道的擴(kuò)增恒河猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的引物。利用RT-PCR的方法，成功的從絨猴總RNA中擴(kuò)增出了全長(zhǎng)的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體基因。擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)約1100bp，采用了1％凝膠電泳的方法進(jìn)行了鑒定，將大小正確的片段采用切膠回收的方式進(jìn)行純化后，將純化過(guò)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至PMD-T

8、載體上，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10，挑取單克隆，酶切鑒定后并將所有的陽(yáng)性克隆送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。
　　 利用DNAMAN5.2.2軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，并將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，利用MEGA4.1軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。進(jìn)化樹采用從Genbank中下載的其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的等位基因作為參考序列。參考序列包括普通棉耳絨猴的MHC classⅠ:Caja-A(xr_091099.1)，Caja-

9、B(xm_002764215.1),Caja-C(xm_002763560.1),Caja-E(ef014284.1),Caja-G01(u59637.1),Caja-G03(u59639.1),Caja-G04(u59640.1),Caja-G05(u59641.1);人類的MHC classⅠ:HLA-A(nm_002116.7),HLA-B(nm_005514.6),HLA-C(nm_002117.4),HLA-E(nm_0055

10、16.5),HLA-F(nm_018950.2),HLA-G(nm_002127.5)，恒河猴:Mamu-A(gu592059.1),Mamu-B(ef580173.1),Mamu-E(nm_001114966.1)，Mamu-F(nm_001042770.2)，以及黑猩猩:Patr-A(dq539672.1)，Patr-B(dq539675.1),Patr-C(af165370.1),Patr-E(nm_001045498.1),Pa

11、tr-F(nm_001129198.1)，Patr-G(nm_001045512.1)。本研究新發(fā)現(xiàn)的絨猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的等位基因提交NCBI Genbank后遞交免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(IPD)進(jìn)行命名。
　　 本研究中，共挑選了355個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，這些克隆分別來(lái)自9只絨猴，每只絨猴所提供的克隆數(shù)從15到92個(gè)不等。由于試驗(yàn)方法的限制，為了確保這些克隆并非是由于人為原因產(chǎn)生的變異，確立了一個(gè)選取陽(yáng)性克隆的方法，即單倍型克

12、隆數(shù)≥2才可以認(rèn)為是確實(shí)存在的等位基因，基于此規(guī)則，從9只絨猴中，共發(fā)現(xiàn)了26條新的MHC-(Ⅰ)等位基因。并對(duì)這26條等位基因以及24條參考序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析。
　　 在26個(gè)新發(fā)現(xiàn)的等位基因中，有15個(gè)Caja-G等位基因，并且他們可以翻譯成完整的功能蛋白。另外11個(gè)等位基因是假基因，其中6個(gè)為Caja-C假基因和5個(gè)為Caja-G假基因。這些假基因由于編碼框移位或者是堿基缺失，導(dǎo)致其不能翻譯成完整的功能蛋白。另外，

13、有6個(gè)假基因都恰巧缺失了編碼α2蛋白的基因。將15個(gè)Caja-G等位基因提交Genbank獲得序列號(hào)并遞交IPD進(jìn)行命名。
　　 在這些序列中，2條序列m01-caja-a16和m13-caja-a09分布在3只絨猴中，5條序列分布在2只絨猴中，剩下的8個(gè)等位基因均出現(xiàn)在1只不同的絨猴個(gè)體中。并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一條等位基因出現(xiàn)在所有或者大部分的絨猴中。新發(fā)現(xiàn)的Caja-G等位基因與Genbank中的Caja-G參考序列相似度高達(dá)96％。

14、在Genbank中，目前只有少數(shù)幾條Caja-G序列，因而Caja-G等位基因還應(yīng)該被更精確的進(jìn)行詳細(xì)劃分。
　　 將這15條新發(fā)現(xiàn)的可以翻譯為完整功能蛋白的等位基因利用DNAMAN軟件翻譯為氨基酸序列。并進(jìn)行兩兩相比。這15條等位基因可以翻譯成兩種大小的功能蛋白，一種大小為359個(gè)氨基酸，另一種大小為362個(gè)氨基酸。而所有這15條等位基因核苷酸兩兩相比后相似度為89.54％到99.91％，氨基酸兩兩相比后相似度為83.51％到

15、100％。m13-caja-a09和m15-caja-a06這兩條等位基因具有不同的核苷酸序列，但可以翻譯成相同的蛋白。
　　 根據(jù)Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體分子的重鏈部分不同的功能，可以將其分為五個(gè)區(qū)域，包括三個(gè)胞外區(qū)（分別記作α1，α2和α3），一個(gè)跨膜區(qū)以及一個(gè)胞漿區(qū)。Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性主要集中在α1，α2區(qū)域中，在本研究中新發(fā)現(xiàn)的等位基因氨基酸序列中，高變區(qū)主要集中在三處，分別是第62到83位氨基酸，第92到1

16、21位氨基酸以及第152-179位氨基酸，而人類HLA超高變區(qū)的位置分別位于第62到83位氨基酸，第92到121位氨基酸以及第135到157位氨基酸。這些區(qū)域的高度多態(tài)性是非常重要的，因?yàn)檫@些區(qū)域所編碼的蛋白共同組成了Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體分子的肽結(jié)合位點(diǎn)。另外，在α3中有一處非常保守的位點(diǎn)，包含有7個(gè)氨基酸，這7個(gè)氨基酸與CD8陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)。
　　 總而言之，本課題通過(guò)對(duì)9只普通棉耳絨猴進(jìn)行研究，新發(fā)現(xiàn)了15個(gè)新的C