鼠重組IL-12腺病毒經(jīng)脂質(zhì)體包埋轉(zhuǎn)染Kupffer細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)體外分離培養(yǎng)并鑒定SD大鼠肝枯否細(xì)胞，得到較高純度及細(xì)胞活力的KCs，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供充足的KCs。(2)構(gòu)建鼠重組IL．12腺病毒，得到能高度及穩(wěn)定表達(dá)IL．12的腺病毒載體，為進(jìn)一步基因治療提供有效基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。(3)利用KCs的吞噬作用，檢測(cè)經(jīng)脂質(zhì)體包埋的鼠重組IL-12腺病毒在KCs中IL．12的表達(dá)，為靶向治療肝癌肝內(nèi)微轉(zhuǎn)移灶的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)采用Ⅳ型膠原酶離體灌注消化、重復(fù)離心等方法將大鼠

2、肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(nonparenchymalcells,NPC)和實(shí)質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)(parenchymalcells)分離開來(lái)，并將NPC進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，進(jìn)一步分離出其中的KCs，相差顯微鏡下觀察KCs的貼壁及生長(zhǎng)情況，臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞產(chǎn)率和存活率。KCs的鑒定：運(yùn)用latexbeads顆粒進(jìn)行KCs吞噬功能實(shí)驗(yàn)；熒光顯微鏡觀察首次換液后的KCs,置328nm波長(zhǎng)下觀察細(xì)胞自發(fā)熒光的情況。(2)利用細(xì)菌內(nèi)重組系統(tǒng)AdEasyTMSys

3、tem，及腺病毒載體pCAl3-miLl2質(zhì)粒，構(gòu)建鼠重組IL．12腺病毒(Adv-mILl2)。PCR法、酶切鑒定證實(shí)重組是否正確。50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCIDS0)法測(cè)定病毒滴度。(3)細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)KCs，共28孔，細(xì)胞濃度為1X106／ml。每7孔為一組，共設(shè)置4組，分別為KC細(xì)胞對(duì)照組、KC+脂質(zhì)體+Ad-miLl2組、KC+Ad-mILl2對(duì)照組、KC+Ad-EGFP病毒對(duì)照組。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7天，每天觀

4、察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，其中KC+Ad-EGFP病毒對(duì)照組熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況；并每天取4組的平行4孔細(xì)胞上清，一80℃冰箱保存，至7天后ELISA試劑盒(mill2)檢測(cè)細(xì)胞上清中mill2的表達(dá)量。 結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)分離所得的肝KCs以培養(yǎng)基稀釋后用O．4％的臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，每只大鼠可得到7．10X106個(gè)細(xì)胞，且細(xì)胞的存活率可達(dá)到95％以上。KCs在倒置顯微鏡下呈圓球形，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中；4h后見部分已貼壁，呈扁圓

5、形，12h見大量細(xì)胞開始伸展生長(zhǎng)貼壁良好，24h時(shí)細(xì)胞己完全展開，細(xì)胞體積明顯增大，外形不規(guī)則，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的星形或多角形，胞漿透明：胞核呈腎形且偏位。吞噬功能實(shí)驗(yàn)相差顯微鏡下見KCs胞漿內(nèi)含有被大量吞噬的latexbeads顆粒。熒光顯微鏡觀察在328nm處未見明顯的細(xì)胞自發(fā)熒光現(xiàn)象。(2)運(yùn)用PCR法、酶切鑒定法對(duì)pShuttle-mlLl2載體及pAdEasy-mLLl2重組子鑒定，均證實(shí)基因重組正確。TCID50方法測(cè)病毒滴度為

6、2．5XlO7pfu／ml。(3)實(shí)驗(yàn)用KCs在培養(yǎng)板中生長(zhǎng)良好，形態(tài)典型。由于不添加新的培養(yǎng)基，至第5天細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，但細(xì)胞形態(tài)改變不顯著。對(duì)照組由于有腺病毒的存在，其細(xì)胞毒作用使得該3組的KC細(xì)胞數(shù)較KC細(xì)胞對(duì)照組為少。KC+Ad-EGFP病毒對(duì)照組在熒光顯微鏡下觀察早期見熒光表達(dá)，隨著KC數(shù)量的減少，熒光表達(dá)有所減少。ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中mill2的表達(dá)量：KC+脂質(zhì)體+Ad-miLl2組、KC+Ad-mILl2對(duì)照

7、組細(xì)胞上清中mill2第1天至第7天均有表達(dá)，且表達(dá)量高，該兩組間無(wú)顯著性差異，且每組各天之間表達(dá)量也無(wú)顯著性差異。KC細(xì)胞對(duì)照組、KC+Ad-EGFP病毒對(duì)照組細(xì)胞上清中未檢測(cè)出或檢測(cè)出極低的mill2，與KC+脂質(zhì)體+Ad-miLl2組、KC+Ad-mILl2對(duì)照組有顯著性差異。 結(jié)論：(1)我們采用Ⅳ型膠原酶離體灌注消化、重復(fù)離心法，原代分離、培養(yǎng)肝KC取得的較為滿意的結(jié)果。所得KCs具有典型的形態(tài)和較高細(xì)胞活力，純度高，

8、為進(jìn)一步研究KCs的功能提供了一套成熟的細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法。(2)成功構(gòu)建了鼠重組IL．12腺病毒，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，能穩(wěn)定、高效表達(dá)IL一12。為IL．12相關(guān)的基因治療提供了高效的基因載體，從而可以在更廣闊的領(lǐng)域得到應(yīng)用，尤其是腫瘤的基因治療。(3)通過(guò)鼠重組IL．12腺病毒經(jīng)脂質(zhì)體包埋轉(zhuǎn)染Kupffer細(xì)胞的研究，并檢測(cè)到KCs細(xì)胞上清中IL．12的高度表達(dá)，證實(shí)了該種方法的可行性和有效性，為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。通過(guò)KCs