白藜蘆醇在黑色素瘤小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)藥效及PK-PD結(jié)合模型研究.pdf

1、第一部分：白藜蘆醇在黑色素瘤小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:探索白藜蘆醇(resveratrol,Res)單次及多次給藥后,C57BL/6荷黑色素瘤小鼠體內(nèi),Res及其主要代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸結(jié)合物(resveratrol-glucuronide,Res-G)和硫酸結(jié)合物(resveratrol-sulfate,Res-S)的藥代動(dòng)力學(xué)特征,并建立相應(yīng)的PK模型,為PK-PD結(jié)合模型提供合適的藥代動(dòng)力學(xué)驅(qū)動(dòng)因素PKinput。<

2、br>　　方法:1)以水楊酸為內(nèi)標(biāo),建立可同時(shí)測(cè)定血漿中Res及主要代謝物Res-G和Res-S的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。2)建立C57BL/6小鼠皮下移植B16F10黑色素瘤模型,單次灌胃給予低、高劑量Res(50、100mg/kg)后,分別于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0h經(jīng)眼眶內(nèi)呲靜脈叢采血,用上述建立的HPL

3、C-MS/MS方法檢測(cè)Res及Res-G,Res-S的血藥濃度,WinNonlin軟件進(jìn)行Res及Res-G,Res-S的藥動(dòng)學(xué)(pharmacokinetics,PK)模型模擬擬合,并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù);3)C57BL/6荷黑色素瘤小鼠灌胃給予低、高劑量Res(50、100mg/kg/d),連續(xù)給藥21d,分別在第3,6,9,12,15,18,21d采樣,于當(dāng)天給藥后0.167、1.0、2.0、4.0h經(jīng)眼眶內(nèi)呲靜脈叢采血,檢測(cè)血藥濃度。

4、參考單次給藥藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)合多次給藥有限采樣的實(shí)測(cè)血藥濃度,采用WinNonlin軟件建立Res長(zhǎng)期給藥過(guò)程中PK模型,模擬擬合Res及Res-G,Res-S的藥時(shí)曲線,并計(jì)算多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果:結(jié)果:黑色素瘤小鼠單次灌胃給予Res后,藥物在體內(nèi)表現(xiàn)出較快的吸收和消除,代謝物Res-G的血藥濃度及明顯高于Res,Res-S的血藥濃度與Res接近;多次給藥過(guò)程中,AUC增加,清除率降低,Res及Res-G、Res-S

5、均表現(xiàn)出一定程度的蓄積。
　　結(jié)論:Res在體內(nèi)吸收消除較快,并快速轉(zhuǎn)化為代謝物,Res-G、Res-S是其循環(huán)過(guò)程中的主要存在形式;多次給藥過(guò)程中,黑色素瘤病情進(jìn)展可影響Res原型及代謝物使之蓄積。
　　第二部分：白藜蘆醇在黑色素瘤小鼠體內(nèi)的藥效動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:研究在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中及Res給藥治療過(guò)程中,腫瘤體積,Tyrosinase,COX-2,Ape/Ref-1,VEGFA及Survivin的動(dòng)態(tài)變

6、化規(guī)律,為PK-PD結(jié)合模型提供合適的藥效替代指標(biāo)PDendpoint。
　　方法:1)建立C57BL/6小鼠皮下移植B16F10黑色素瘤模型,分為3組:模型對(duì)照組(0.5％CMC-Na),低、高劑量Res組(50、100mg/kg/d),連續(xù)灌胃21d,監(jiān)測(cè)腫瘤體積;分別于開(kāi)始給藥后第3,6,9,12,15,18,21d分批處死動(dòng)物,剖取腫瘤組織;2)提取mRNA,普通PCR擴(kuò)增后回收,構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用絕對(duì)

7、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)Tyrosinase,COX-2,Ape/Ref-1,VEGFA,Survivin的mRNA表達(dá);制備組織勻漿,BCA法測(cè)總蛋白濃度,采用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測(cè)上述各指標(biāo)的蛋白表達(dá);制備酶液,通過(guò)檢測(cè)催化特異性底物的反應(yīng),計(jì)算Tyrosinase和COX-2的酶活性;提取細(xì)胞核蛋白,采用DNA-binding Elisa法檢測(cè)Ape/Ref-1的氧化還原活性;
　　結(jié)果:隨著時(shí)間推移,荷瘤小鼠腫瘤

8、體積逐漸增大,Tyrosinase,COX-2及Survivin的活性或表達(dá)逐漸升高,Ape/Ref-1先升后降,VEGFA初期無(wú)明顯變化,在第9-12天開(kāi)始上升;Res能夠降低腫瘤生長(zhǎng)速度,下調(diào)COX-2,Ape/Ref-1,VEGFA,Survivin的mRNA和蛋白表達(dá),同時(shí)抑制Tyrosinase,COX-2和Ape/Ref-1的活性,但對(duì)Tyrosinase的mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響,上述作用呈動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)論:

9、Tyrosinase,COX-2,Ape/Ref-1,VEGFA及Survivin在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化,Res可抑制小鼠黑色素瘤生長(zhǎng),并從不同水平影響上述各指標(biāo)。
　　第三部分：白藜蘆醇在黑色素瘤小鼠體內(nèi)的PK-PD結(jié)合模型研究
　　目的:建立PK-PD結(jié)合模型,量化Res的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)聯(lián),闡明Res的藥動(dòng)學(xué)行為與藥理學(xué)效應(yīng)之間的“矛盾”,有助于闡明Res的作用機(jī)制,明確作用靶標(biāo)。
　

10、　方法:1)分別將Res及代謝物的血藥濃度C和藥時(shí)曲線下面積AUC,與不同的藥效指標(biāo)進(jìn)行模型擬合,明確藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程的驅(qū)動(dòng)因素PKinput。2)根據(jù)上述確定的PKinput,分別采用不同的藥效動(dòng)力學(xué)模型和初始參數(shù),建立可定量描述PKinput與腫瘤體積之間關(guān)系的PK-PD結(jié)合模型。3)將PKinput的動(dòng)態(tài)變化,分別在活性、mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)水平,與Tyrosinase,COX-2,APE/Ref-1,VEGFA,Survivin

11、等藥理效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行擬合,選擇相關(guān)性較好的效應(yīng)指標(biāo)作為PDendpoint。4)選擇合適的藥代動(dòng)力學(xué)模型和藥效動(dòng)力學(xué)模型,建立聯(lián)接PKinput和PDendpoint的PK-PD結(jié)合模型,得到模型動(dòng)力學(xué)參數(shù),明確Res的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)之間的定量關(guān)系
　　結(jié)果:1)相比血藥濃度C,Res及代謝物的總藥時(shí)曲線下面積AUCRes-Total的能夠較好地與各藥效指標(biāo)擬合,可作為PKinput獲得較滿(mǎn)意的PK-PD模型。2)指數(shù)方程結(jié)

12、合SigmoidEmax模型可較好地量化擬合腫瘤體積與AUCRes-Total的關(guān)系。3)SimpleEmax可較好地?cái)M合COX-2酶活性、mRNA及蛋白表達(dá)與AUCRes-Total的關(guān)系。4)SigmoidEmax模型可較好地量化擬合Tyrosinase的活性,VEGFA、Survivin的mRNA及蛋白表達(dá)與AUCRes-Total的關(guān)系。
　　結(jié)論:1)主要代謝物Res-G,Res-S在Res的體內(nèi)活性中起到重要作用,這可