RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及對(duì)急性T系白血病細(xì)胞CD59基因沉默效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建 RNAi- CD59慢病毒載體，研究其對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat CD59的沉默效應(yīng)，運(yùn)用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討CD59特異性沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的作用。
　　方法體外實(shí)驗(yàn):免疫熒光比較正常人T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞上的CD59表達(dá)情況；構(gòu)建 CD59干擾序列（RNAi-CD59-A、RNAi-CD59-B、RNAi-CD59-C)以及錯(cuò)義序列(RNAi-NC)融合綠色熒光蛋白，以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入人急性

2、T系白血病Jurkat細(xì)胞株，陰性對(duì)照為RNAi-NC，空白對(duì)照組為未經(jīng)任何處理的正常培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞系；運(yùn)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率； RT-PCR檢測(cè)各組CD59基因以及凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax mRNA的表達(dá)；Western-blot檢測(cè)各組CD59蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、 Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)水平的變化；激光共聚焦觀察CD59分子的定位；ELISA檢測(cè)各組細(xì)

3、胞培養(yǎng)上清中IL-3、TNF-P的表達(dá)；CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖效率的改變；流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞凋亡水平的變化。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):24只BALB/c-nu雌性裸鼠隨機(jī)分為4組(PBS組、Jurkat組、RNAi-NC組、RNAi-CD59-A組），將培養(yǎng)篩選后的細(xì)胞系通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入裸鼠體內(nèi)構(gòu)建裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，注射前后0周、1周、2周、3周、4周，監(jiān)測(cè)小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)、小鼠體質(zhì)量及外周血白細(xì)胞數(shù)量的變化；流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)觀察小鼠外周

4、血及骨髓中淋巴細(xì)胞的凋亡情況；ELIS A檢測(cè)各組小鼠血液上清中IL-3、TNF-P的表達(dá)。
　　結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)：熒光顯微鏡和FCM觀察轉(zhuǎn)染效率在90.00%以上； RT-PCR結(jié)果顯示沉默組CD59、 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低(P＜0.05)，Bax mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.05); Western-blot結(jié)果顯示沉默組CD59、Bax、Survivin蛋白的表達(dá)量減少，Bcl-2, caspase-3蛋白的表達(dá)量

5、增多(P＜0.05);激光共聚焦觀察到CD59分子主要定位于細(xì)胞膜；ELIS A結(jié)果顯示沉默組IL-3表達(dá)水平降低，TNF-P的表達(dá)水平升高(P＜0.05)；CCK8結(jié)果顯示RNAi-CD59-A組的細(xì)胞增殖效率明顯降低(P＜0.05);流式細(xì)胞儀觀察到RNAi-CD59-A組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物模型構(gòu)建成功，與 PBS組相比，各模型組裸鼠體質(zhì)量均有一定的下降（P＜0.05)，其中沉默組裸鼠體

6、質(zhì)量下降不如RNAi-NC組和Jurkat細(xì)胞組明顯（P<0.05);與 PBS組相比，各模型組外周血白細(xì)胞數(shù)均有明顯的升高(P＜0.05)，其中與Jurkat細(xì)胞和RNAi-NC組相比，沉默組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少（P＜0.05);流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示沉默組外周血和骨髓細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡率明顯高于未沉默組(P＜0.05)；ELIS A結(jié)果顯示小鼠血液上清中沉默組IL-3表達(dá)水平降低，TNF-P的表達(dá)水平升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論