BDNF基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及BDNF-GFP融合蛋白對神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化影響的研究.pdf

1、目的: 通過構(gòu)建SD大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BDNF，并將其轉(zhuǎn)染到胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)中，觀察轉(zhuǎn)染的NSCs中BDNF-GFP融合蛋白的表達(dá)、以及融合蛋白對NSCs細(xì)胞的增殖和分化的影響，為下一步進(jìn)行NSCs移植治療腦損傷及退行性腦疾病提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。 方法: 通過設(shè)計(jì)BDNF的特異性引物，用RT-PCR的方法從SD大鼠海馬組織中獲取BDNF基因序列片段，將其克隆入真核細(xì)胞表達(dá)載

2、體pEGFP-N1中，通過PCR、雙酶切鑒定后，選出陽性克隆進(jìn)行DNA測序鑒定。將構(gòu)建成功的pEGFP-N1-BDNF重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞和NSCs細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。用RT-PCR檢測BDNFmRNA表達(dá)情況；用免疫印跡、ELLAS法檢測BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)情況；用MTT比色法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究BDNF-GFP融合蛋白對NSCs細(xì)胞增殖和分化的影響。 結(jié)

3、果: 1.重組質(zhì)粒通過質(zhì)粒PCR、雙酶切后電泳顯示存在與BDNF目的基因大小相同的條帶，DNA測序結(jié)果顯示與Genebank公布的BDNF基因序列比較只有一個(gè)突變位點(diǎn)，但不影響正常BDNF蛋白的表達(dá)。 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，RT-PCR鑒定顯示只有轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的COS-7細(xì)胞有BDNF mRNA表達(dá)：免疫印跡檢測顯示，僅轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的COS-7細(xì)胞有BDNF-GFP融合蛋白

4、表達(dá)，在48h以未成熟BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)為主，在96h以成熟BDNF-GFP融合蛋白表達(dá)為主。 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞后，RT-PCR鑒定顯示只有轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的NSCs細(xì)胞有BDNF mRNA表達(dá)；ELLAS檢測顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的NSCs細(xì)胞在72-96h分泌的BDNF-GFP融合蛋白的量達(dá)高峰；MTT結(jié)果提示BDNF-GFP融合蛋白有抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用；免疫細(xì)胞化學(xué)檢