去氫甲睪酮的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)與方法研究.pdf

1、去氫甲睪酮(1-Dehydro-17a-methyltestosterone,DMT)是一種人工合成的雄性甾醇類(lèi)蛋白同化激素,在臨床醫(yī)學(xué)和畜牧養(yǎng)殖中有著廣泛的應(yīng)用,但它在人體內(nèi)的積累會(huì)給人體健康造成嚴(yán)重威脅。國(guó)內(nèi)外已出臺(tái)相關(guān)的法律法規(guī)明確禁止DMT在畜牧生產(chǎn)中的使用。為有效地監(jiān)控動(dòng)物源性食品中的DMT’殘留,有必要研究和建立新型快速、靈敏的DMT檢測(cè)方法。
　　 目前DMT殘留檢測(cè)主要采用高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜

2、聯(lián)用法(GC/MS)、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)等儀器分析方法。但由于其操作步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高等原因而不適于基層以及大批量樣品的篩查與檢測(cè)。而免疫學(xué)檢測(cè)方法以其較高的靈敏性、特異性、簡(jiǎn)便性和批量性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)。本研究旨在研制快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中DMT殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試劑盒,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.復(fù)蘇并擴(kuò)大培養(yǎng)了能穩(wěn)定分泌DMT抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株1D6F1084,

3、采用小鼠腹水法制備單克隆抗體。用正辛酸-飽和硫酸銨法和飽和硫酸銨沉淀法對(duì)其進(jìn)行純化,分別用ELISA和SDS-PAGE對(duì)純化后的單克隆抗體進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示正辛酸-飽和硫酸銨法純化單抗結(jié)果較好。測(cè)定制得單抗的親和力達(dá)到9.87×107L/mol,屬于高親和力抗體;測(cè)定制得的單抗與DMT結(jié)構(gòu)類(lèi)似物TP、TB的交叉反應(yīng)率均小于1%,有較好的特異性,達(dá)到制備ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)需求。
　　 2.確定了ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)所需要的最佳

4、包被濃度為1μg/mL,抗體工作濃度為稀釋8000倍;確定了最佳包被條件為以0.05M的CBS作為包被緩沖液(pH9.6)4℃包被過(guò)夜,最佳封閉條件為以3%聚乙二醇作為封閉液37℃封閉2h;確定DMT標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的體積比選擇為50:50,競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為50min;最佳酶標(biāo)二抗稀釋度為1:8000,酶標(biāo)二抗作用時(shí)間為60min;底物緩沖液與TMB儲(chǔ)存液的體積比為20:1,顯色時(shí)間選擇為15min;洗液中Tween-20濃度為0.5%。試劑盒標(biāo)

5、準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)典型的S型,線性范圍在0.1～100ng/mL;從靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、特異性和穩(wěn)定性五個(gè)不同方面評(píng)估了制備的DMT-ELISA試劑盒:最低檢測(cè)限范圍為0.055±0.012ng/mL,IC50范圍為3.059±0.169ng/mL;對(duì)豬肉添加試驗(yàn)的回收率在87.41%～110.70%,變異系數(shù)為2.05%～10.81%;標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為3.16%～4.64%,樣品可重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為6.97%～10.48%;

6、對(duì)DMT的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物TP和TB的交叉反應(yīng)率均＜1%;在4℃下保存6個(gè)月后,其整體水平仍能滿足試劑盒的檢測(cè)要求。
　　 3.研究了豬肉、豬肝、飼料、尿液、雞蛋5種樣品的前處理方法,優(yōu)化了前處理?xiàng)l件。用試劑盒分別測(cè)定DMT的低、中、高濃度下的回收率,然后通過(guò)與HPLC方法比對(duì)來(lái)驗(yàn)證ELISA試劑盒方法的有效性:豬肉樣品的最佳有機(jī)提取劑為10%甲醇,ELISA試劑盒測(cè)定的回收率為90.85%～104.84%,CV為3.49%～12.4

7、1%,HPLC方法測(cè)定的回收率為91.01%～100.82%,CV為1.88%～6.27%;豬肝樣品的最佳有機(jī)提取劑為正己烷,ELISA試劑盒測(cè)定的回收率為97.80%～103.01%,CV為10.08%～14.13%,HPLC方法測(cè)定的回收率為92.41%～100.94%,CV為0.36%～4.38%;飼料樣品的最佳有機(jī)提取劑為80%乙腈,ELISA試劑盒測(cè)定的回收率為90.08%～91.68%,CV為1.64%～11.73%,HPL

8、C方法測(cè)定的回收率為87.98%～89.34%,CV為0.46%～1.01%;尿液樣品的最佳有機(jī)提取劑為乙酸乙酯-二氯甲烷(4:1),ELISA試劑盒測(cè)定的回收率為87.11%～90.48%,CV為2.73%～7.63%,HPLC方法測(cè)定的回收率為87.71%～92.00%,CV為0.23%～0.44%;雞蛋樣品的最佳有機(jī)提取劑為甲醇,ELISA試劑盒測(cè)定的回收率為89.35%%～05.16%,CV為3.64%～12.60%,HPLC方