天麻素對(duì)化療誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏的抑制作用.pdf

1、　　目的：觀察天麻素對(duì)長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏模型大鼠的預(yù)防及治療作用,并研究其對(duì)大鼠脊髓背角星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及 TNFα、IL-1β 等炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響,探討其在脊髓水平的作用機(jī)制。
　　方法：(1) 建立化療誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏模型的方法：挑選出痛閾合格的成年SD大鼠,隨機(jī)分為2組,分別為生理鹽水對(duì)照組和長(zhǎng)春新堿模型組。模型組隔日一次腹腔注射長(zhǎng)春新堿(125μg/kg),對(duì)照組同步注射生理鹽水(0.5ml/100g)

2、,以首次給藥當(dāng)天為第一天(D1),給藥前測(cè)定一次痛閾值,給藥后于第2天開始隔日做行為學(xué)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)大鼠機(jī)械刺激和熱刺激痛閾值。當(dāng)模型組大鼠痛閾值明顯降低時(shí),即模型建立成功,記錄給藥總次數(shù)。(2) 行為學(xué)方法觀察天麻素對(duì)化療誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏的作用：取健康SD大鼠30只,隨機(jī)區(qū)組法分為5組,分別為生理鹽水對(duì)照組,長(zhǎng)春新堿模型組,小、中、大天麻素劑量組(30mg/kg,60mg/kg,120mg/kg)。首先,建立化療誘導(dǎo)的痛覺過(guò)敏模型,即除對(duì)照組

3、用生理鹽水對(duì)照外,其它四組隔日腹腔注射VCR,共4次,模型建立成功后,于第9天藥物治療組開始腹腔注射天麻素,對(duì)照組和模型組用生理鹽水同步對(duì)照,分別于治療1-2周后,行為學(xué)方法檢測(cè)記錄大鼠的痛閾值變化。(3) 免疫組化法測(cè)定大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的狀況：分組及處理方法同(2)。于末次治療第2天,用2%戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉大鼠,然后用4%多聚甲醛對(duì)大鼠行活體灌流,取大鼠脊髓腰膨大,固定、脫水、包埋處理,并做石蠟切片,采用免疫組化S

4、V法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。(4)免疫熒光方法檢測(cè)大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀況：分組及處理方法同(2) 。大鼠取材方法同(3),取出腰膨大后固定,蔗糖脫水,冰凍切片,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物物Iba-1的表達(dá)。(5) 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠脊髓IL-1β和TNFα的表達(dá)變化：分組及處理同(2)。用天麻素治療1周后,于末次治療第2天,大鼠用20%烏拉坦(1ml/100g)深麻醉下斷頭處死。取出脊髓腰膨大處,加

5、入預(yù)冷的生理鹽水,用勻漿器按1：9(W/V)的比例制成10%的組織勻漿,于4℃離心機(jī), 3500r/min 離心10min,提取上清液于-20℃凍存待測(cè)。采用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。(6) MTT法檢測(cè)天麻素對(duì)長(zhǎng)春新堿殺傷癌細(xì)胞的影響：將VCR按6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μg/m l濃度加入含有乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的培養(yǎng)孔中,細(xì)胞濃度2-4×104,培養(yǎng)24小時(shí),用噻唑藍(lán) (MTT )比色法測(cè)定O

6、D值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)；將天麻素按0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5mg/ml濃度單獨(dú)加入含有MCF-7的培養(yǎng)孔中,同時(shí)將VCR和天麻素聯(lián)合用于MCF-7,培養(yǎng)24小時(shí),MTT法測(cè)定OD值,計(jì)算生存率。
　　結(jié)果：(1) 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)第8天化療誘導(dǎo)的痛覺過(guò)敏模型成功建立,用不同劑量天麻素治療模型大鼠1周后,治療組大鼠的機(jī)械和熱刺激痛閾值與模型組比較均有不同程度的提高(P

7、<0.05,P<0.01)。(2) 免疫組化實(shí)驗(yàn)中,模型組的脊髓灰質(zhì)中可見GFAP表達(dá)明顯增強(qiáng),提示星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化,而治療組與模型組比較, GFAP表達(dá)明顯減弱。(3) 免疫熒光實(shí)驗(yàn)中,模型組脊髓灰質(zhì)中Iba-1表達(dá)明顯增強(qiáng),提示小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化,治療組與模型組比較,Iba-1的表達(dá)均有不同程度的減弱,表明天麻素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。(4)在酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)第 8 天痛覺過(guò)敏大鼠模型成功建立,用不同劑量天麻素治療后,與

8、模型組比較,治療組大鼠的IL-1β和TNFα的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。(5)在觀察天麻素對(duì)長(zhǎng)春新堿殺傷癌細(xì)胞作用的影響實(shí)驗(yàn)中,天麻素單獨(dú)加入含有MCF-7的培養(yǎng)孔后,對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)顯著的影響(P>0.05),天麻素和長(zhǎng)春新堿同時(shí)加入含有MCF-7的培養(yǎng)孔后,天麻素對(duì)VCR殺傷癌細(xì)胞作用無(wú)顯著影響 (P>0.05)。
　　結(jié)論：天麻素可減輕長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的大鼠痛覺過(guò)敏反應(yīng),其減輕化療誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制,可能與其抑制脊髓背角星形