MicroRNA-126敲減對CD4+T細胞功能的影響.pdf

1、CD4+輔助性T細胞（CD4 helper cells，Th細胞）是機體T細胞的重要功能群體，在機體的適應性免疫應答中發(fā)揮了關鍵作用。通常情況下，初始CD4+T細胞在活化后可分化為Th1細胞、Th2細胞、CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Tregs）、輔助性T細胞17型（T helper17，Th17細胞）和濾泡輔助性T細胞（Follicular helper T cells，Tfh細胞）等5個主要亞

2、群。新近研究顯示，局部微環(huán)境細胞因子的差異和相關特定轉錄因子的活性水平可顯著影響初始 CD4+T細胞分化為Th細胞各個亞型的過程。大量研究表明，CD4+T細胞在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等臨床疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，然而關于CD4+T細胞功能的調控機制至今仍未完全闡明。
　　微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類由內源基因編碼的參與基因轉錄后水平調控的長約22-24個核苷酸的非編碼蛋白質的單鏈RNA

3、，其能與目的基因的3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）結合，在轉錄后水平通過促進靶mRNA的降解或抑制蛋白質翻譯來負調控目的基因的表達。miRNAs在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡和糖脂代謝等一系列生物學進程中發(fā)揮了重要的調控作用。近年來越來越多的研究報道，miRNAs參與了CD4+T細胞的發(fā)育和功能調控過程，影響了臨床相關疾病如炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。因此，分析特定的miRNAs與CD4+T

4、細胞之間的關系將有助于揭示CD4+T細胞功能維持及調控疾病的分子機制。
　　miR-126是miRNAs家族中重要的一員，位于EGFL7基因7號內含子中，其在血管和心臟、肺等組織器官的內皮細胞中高表達。新近大量研究報道m(xù)iR-126與免疫細胞的發(fā)育和功能維持過程密切相關。此外，我們課題組前期也發(fā)現(xiàn)miR-126可通過PI3K/AKT調控CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的外周誘導，提示其在機體免疫應答中具有重要調控作用。然而，miR-

5、126與CD4+ T細胞功能的相關關系至今仍不十分明確。本研究擬利用miR-126基因敲減小鼠模型，探討miR-126對CD4+T細胞功能的影響以及可能分子機制，以期為后續(xù)深入探討miR-126在免疫應答中的作用及機制提供前期實驗基礎。
　　本研究包括三部分內容，分述如下：
　　目的：
　　第一部分利用miRNA-Sponge技術，設計 miR-126-Sponge序列，構建靶向miR-126的真核表達載體pEGFP-

6、C2-miR-126-Sponge(海綿體)，制作miR-126基因敲減（knock down，KD）小鼠模型，并觀察小鼠各重要組織器官的病理學變化。
　　第二部分利用免疫熒光技術和流式檢測技術，結合實時熒光定量 PCR技術，從體內外探討miR-126敲減后對CD4+T細胞活化、增殖和相關細胞因子分泌等功能以及凋亡的影響。
　　第三部分利用基因芯片技術和實時熒光定量 PCR技術，結合 Targets Scan軟件和Weste

7、rn Blot技術，初步探討miR-126對CD4+T細胞功能影響的分子機制。
　　方法：
　　第一部分：設計并合成miR-126-Sponge序列，構建靶向miR-126的真核表達載體pEGFP-C2-miR-126-Sponge，利用FVB背景的小鼠，在廣州賽業(yè)公司的支持下，制作miR-126KD小鼠。然后分別抽提第8-12周WT小鼠和miR-126KD小鼠的腎、腸、肺和肝等12個重要生命器官的總 RNA，檢測 miR-

8、126的下調效率；同時觀察WT小鼠和miR-126KD小鼠體重和外周血糖變化，HE染色檢測肺、肝、脾和胸腺等器官的病理改變，并計數(shù)脾、胸腺等免疫器官的細胞總數(shù)；最后流式儀檢測CD4+T細胞的比例改變。
　　第二部分：免疫熒光技術檢測WT小鼠和miR-126KD小鼠脾組織CD4+ T細胞的組成和分布改變；利用MACS技術分選CD4+CD62L+T細胞后，實時熒光定量PCR技術檢測 miR-126的表達；體外無菌條件下獲得脾組織單細胞

9、懸液，用ConA或抗CD3/CD28抗體加IL-2刺激淋巴細胞，顯微鏡下觀察增殖效率，流式儀檢測CD4+ T細胞的活化、增殖和相關細胞因子分泌的變化；同時用實時熒光定量 PCR技術檢測CD4+ T細胞相關細胞因子表達的改變；最后用PI染色法檢測CD4+ T細胞的凋亡情況和用DSS誘導的腸炎模型和過繼傳輸試驗探討在體內miR-126對CD4+T細胞功能的影響。
　　第三部分：提取WT小鼠和miR-126KD小鼠脾淋巴細胞總RNA，送

10、基因芯片測序，篩選出差異表達基因；運用Targets scan和miRWalk軟件預測miR-126可能作用的靶分子，經(jīng)篩選，選定 IRS-1作為 miR-126的靶分子；進一步利用實時熒光定量PCR檢測WT小鼠和miR-126KD小鼠脾CD4+CD62L+ T細胞中IRS-1的表達變化Westernblot技術檢測WT小鼠和miR-126KD小鼠脾淋巴細胞AKT、ERK、NF-κB的磷酸化水平。
　　結果：
　　第一部分：

11、電泳結果和測序結果顯示，成功構建pEGFP-C2-miR-126-Sponge真核表達載體；將其轉染肝癌HepG2細胞后，實時熒光定量PCR檢測結果顯示，miR-126的表達水平顯著下調（p<0.05）；在廣州賽業(yè)公司的支持下，成功制作miR-126KD小鼠；進一步利用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-126KD小鼠的肺、肝、腎等重要生命器官的miR-126的表達水平顯著下調（p<0.05）；體重監(jiān)測結果顯示，miR-126KD小鼠的

12、體重增長速度從第10周起明顯高于WT小鼠（p<0.05）；同時，miR-126KD小鼠的外周血糖水平在第7周和第16周顯著高于WT小鼠（p<0.05）。HE染色結果顯示，miR-126KD小鼠的肺、肝及腎等的病理結構發(fā)生顯著改變。更重要的是，miR-126KD小鼠脾重量和細胞總數(shù)明顯增加(p<0.05），且流式檢測結果顯示，miR-126KD小鼠的CD4+T細胞的比例顯著增加（p<0.05）。
　　第二部分：免疫熒光共聚焦試驗結果

13、顯示，miR-126KD小鼠脾組織中CD4+T細胞顯著高于WT小鼠；體外脾細胞增殖試驗顯示，miR-126KD小鼠CD4+T細胞增殖加快；同時，流式檢測結果進一步顯示，在活化狀態(tài)下，miR-126KD小鼠CD4+T細胞 CD69、CD44、ki-67、BrdU的比例顯著增加，而CD62L的比例顯著減少，相關IL-4的表達顯著減少，IFN-γ的表達顯著上調（p<0.05），而在未活化狀態(tài)下，BrdU的改變不明顯；同時實時熒光定量PCR檢測

14、結果表明，miR-126KD小鼠IL-4和IL-10的表達顯著下調，而IL-12、TGF-β、TNF-α、IFN-γ的表達顯著上調（p<0.05）；最后PI染色法檢測顯示，miR-126KD小鼠CD4+T細胞凋亡的比例明顯減少（p<0.05），體內試驗結果顯示，miR-126敲減后增強了CD4+T細胞的活化、增殖能力。
　　第三部分：基因芯片分析篩選出大量差異表達的基因，與WT小鼠相比，IRS-1的表達上調2.7005倍；運用Ta

15、rgetScan和miRWalk軟件預測，miR-126可與IRS-1的3’UTR結合，提示IRS-1是miR-126作用的靶分子；實時熒光定量PCR結果顯示，miR-126KD小鼠CD4+T細胞中IRS-1的表達顯著上調（p<0.05）；最后，Western blot檢測結果顯示，miR-126KD小鼠CD4+T細胞中AKT、ERK、NF-κB的磷酸化水平顯著增加（p<0.05）。
　　結論：
　　第一部分：成功制作靶向m

16、iR-126的基因敲減小鼠；同時，miR-126敲減后，小鼠各重要組織器官均發(fā)生明顯病理改變，且脾CD4+T細胞的比例顯著增加。
　　第二部分：miR-126敲減后，CD4+T細胞活化、增殖和相關細胞因子的分泌均明顯增強，而凋亡明顯減少，表明miR-126能顯著調控CD4+T細胞的功能。
　　第三部分：miR-126敲減后，miR-126KD小鼠CD4+T細胞IRS-1和磷酸化AKT的表達水平均顯著上調，提示miR-126可