單核細胞增生李斯特菌InlA、InlB、InlJ對MBMEC細胞骨架與細胞間緊密連接影響的研究.pdf

1、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),是一種食源性胞內(nèi)致病菌,該菌可穿越人和動物腸屏障、血胎屏障及血腦屏障,在臨床上引起腦膜炎、腦膜腦炎、敗血癥及孕畜(婦)流產(chǎn)等疾病,臨床病死率可達到20％-30%。LM引起中樞系統(tǒng)疾病過程中涉及許多毒力因子,尤其是內(nèi)化素家族蛋白InlA、InlB、InlJ等毒力因子在黏附、侵襲宿主細胞中扮演重要角色,但這些毒力因子在 LM穿越宿主血腦屏障過程中具體機制尚不清楚,本

2、研究以4b型食源性LM681及臨床綿羊腦炎分離株LM90為親本株,構(gòu)建inlA、inlB和inlJ基因單缺失突變株,培養(yǎng)鼠腦微血管內(nèi)皮細胞,體外構(gòu)建血腦屏障模型,為進一步研究inlA、inlB和inlJ毒力因子在LM穿越血腦屏障過程中具體作用及機制奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、LM681、LM90內(nèi)化素基因inlA、inlB、inlJ單缺失突變株的構(gòu)建:運用融合 PCR( SOE-PCR)和同源重組技術(shù)構(gòu)建 LM單基

3、因缺失株 LM90-△X和LM681-△X(X為 inlA、inlB、inlJ)。37℃、無氯霉素壓力條件下傳代培養(yǎng)15代,PCR檢測無毒力返祖現(xiàn)象,表明突變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　2、LM基因缺失株部分生物學(xué)特性的研究:以親本株為對照,inlA、inlB及inlJ基因突變株對小鼠 LD50高出101.5、101.3和101.33倍,但差異不顯著;溶血性無差異;對鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(MBMEC)的黏附率、侵襲率及不同時間段

4、內(nèi)胞內(nèi)增殖能力都明顯降低,其中侵襲率差異極顯著(P<0.05),inlB缺失后小鼠肝、脾、腦載菌量降低但差異不顯著,各基因缺失株耐堿不耐酸特性與親本株基本一致,但耐堿性高于親本株。結(jié)果表明,inlA、inlB和inlJ基因的缺失可減弱LM毒力,inlB和inlJ與LM抗酸應(yīng)激相關(guān)。
　　3、LM基因缺失株感染MBMEC后對細胞骨架與細胞間緊密連接的影響: LM和各缺失株感染MBMEC后,通過免疫熒光標記作用后發(fā)現(xiàn),LM和LM90-