單增李斯特菌溶源性噬菌體的分離鑒定及部分基因功能研究.pdf

1、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一種重要的人獸共患病原菌,噬菌體是一類專一寄生的細(xì)菌病毒,具裂解循環(huán)或溶源循環(huán)。PCR及其擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定顯示38株單增李斯特菌分離株中的16株在tRNAArg位點(diǎn)攜有原噬菌體,利用絲裂霉素 C誘導(dǎo)獲得一株溶源性噬菌體,透射電子顯微鏡觀察表明該噬菌體為長(zhǎng)尾噬菌體,命名為W001,DNaseI、RNaseA和綠豆核酸酶消化噬菌體基因組的結(jié)果確認(rèn)其核酸為dsDNA。鳥槍

2、法測(cè)定W001基因組序列,run-off法確認(rèn)其基因組末端具有COS位點(diǎn)5’-CGGTGTGGGG-3’, W001基因組全長(zhǎng)為42,227個(gè)堿基,由66個(gè)開放閱讀框組成,噬菌體整合核心序列attPP’-AATCCCTCTCAGGACG位于噬菌體整合酶下游。
　　第20個(gè)開放閱讀框編碼全長(zhǎng)為281個(gè)氨基酸的噬菌體裂解酶PLYW001,該酶由NH2端的催化結(jié)構(gòu)域(Enzymatically Active Domain, EAD和CO

3、OH端的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cell-wall Binding Domain,CBD)組成,利用大腸桿菌表達(dá)并制備裂解酶,Ni柱純化,Bradford法定量裂解酶蛋白濃度,濁度遞減法測(cè)定 PLYW001的裂解活性和裂解譜, PLYW001可裂解包括噬菌體 W001宿主菌 HA1073、EGDe、10403s在內(nèi)的1/2a血清型的單增李斯特菌;氨基酸替換突變研究結(jié)果顯示位于裂解酶PLYW001催化結(jié)構(gòu)域的7個(gè)氨基酸(45R、50Q、64S、66H

4、、73D、115D和118H)與裂解酶活性相關(guān)。
　　PCR分別擴(kuò)增EGFP和裂解酶CBD編碼基因,構(gòu)建載體pET28a-EGFP-CBD,大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 EGFP-CBD,Ni株純化制備EGFP-CBD,激光共聚焦顯微鏡觀察證明CBD可結(jié)合于單增李斯特菌細(xì)胞壁。
　　在整合酶作用下,噬菌體基因組DNA以attPP’位點(diǎn)特異性整合至宿主細(xì)菌基因組DNA的attBB’位點(diǎn)。利用噬菌體W001的整合酶構(gòu)建非李斯特菌復(fù)制型質(zhì)