大豆苷原對骨形成的量效作用及Ers-PPARγ的調(diào)節(jié)機制.pdf

1、研究背景：
　　絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病率逐年增高，雌激素替代治療(estrogen replacement therapy，ERT)雖能減少絕經(jīng)后婦女的骨丟失及骨折發(fā)生率，但由于長期使用可能導(dǎo)致乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險性增加等安全問題使其應(yīng)用受到限制。大豆苷原(daidzein，DAI)是一種常見的植物雌激素(phytoestrogen，PE)，有雌激素樣效應(yīng)而無雌

2、激素樣副作用，近年來引起了人們廣泛關(guān)注。最近的研究提示植物雌激素的骨保護作用具有劑量依賴性的雙相作用特點，其機制尚不清楚，雌激素受體(estrogen receptors，ERs)和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors gamma，PPARγ)可能參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)機制，但相關(guān)研究報道較少，具體作用機制也不清楚。
　　第一部分大豆苷原防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的

3、量效作用及其對骨髓細胞ERs和PPARγ表達的影響
　　目的：
　　研究不同劑量大豆苷原對去卵巢大鼠血清E2、ALP、脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)，骨密度(BMD)，以及對骨髓細胞ERα、ERβ和PPARγ mRNA和蛋白表達水平的影響，探討大豆苷原防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的量效作用，及其對骨髓細胞ERs和PPARγ表達的影響。
　　方法：
　　將3月齡SD(Sprague Dawley

4、)雌性大鼠(由復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供)隨機分為6組：假手術(shù)組(sham)、去卵巢組(行雙側(cè)卵巢切除ovariectomy，OVX)、去卵巢+戊酸雌二醇組(E2，戊酸雌二醇800μg/kg·d)、去卵巢+高劑量大豆苷原組(H-DAI，大豆苷原200 mg/kg·d)、去卵巢+中劑量大豆苷原組(M-DAI，大豆苷原50 mg/kg·d)和去卵巢+低劑量大豆苷原組(L-DAI，大豆苷原10 mg/kg·d)，除假手術(shù)組外，其余大鼠均切除卵

5、巢，術(shù)后4周開始以相應(yīng)的藥物灌胃，3月后處死大鼠。取血清檢測E2、ALP、脂聯(lián)素及瘦素水平；取腰椎骨L1-5和左股骨檢測骨密度后，脫鈣行骨切片HE染色觀察骨組織形態(tài)。從右股骨骨髓腔內(nèi)提取出骨髓細胞，Realtime-RT-PCR方法檢測骨髓細胞ERα、ERβ和PPARγ mRNA表達，western blot法檢測ERα、ERβ和PPARγ蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、E2組和L-DAI組血清E2、ALP、adipon

6、ectin及l(fā)eptin濃度顯著高于OVX組(P<0.05)；除了leptin濃度外，L-DAI組血清E2、ALP、adiponectin濃度顯著高于E2組(P<0.05)。H-DAI和M-DAI組間血清E2、ALP、adiponectin及l(fā)eptin濃度無顯著差異(P>0.05)，均顯著低于E2和L-DAI組(P<0.05)。
　　2、sham組大鼠的左股骨及腰椎BMD均顯著高于其他各組(P<0.05)。L-DAI組大鼠左股骨

7、及腰椎BMD均比OVX組顯著增高(P<0.05)，且E2組無顯著性差異(P>0.05)。M-DAI組大鼠股骨BMD顯著高于OVX組(P<0.05)，與E2及L-DAI組無顯著性差異(P>0.05)；M-DAI組腰椎BMD與OVX組無顯著性差異(P>0.05)。H-DAI組大鼠的左股骨及腰椎BMD顯著低于L-DAI組(P<0.05)，與OVX組無明顯差異(P>0.05)。
　　3、大鼠左股骨及腰椎骨組織形態(tài)：與sham組比較，OVX

8、組骨小梁數(shù)量顯著降低，脂肪細胞顯著增多。E2可增加骨小梁數(shù)量，減少脂肪細胞。大豆苷原三個劑量組中，L-DAI組可顯著增加骨小梁數(shù)目及抑制脂肪生成；隨著大豆苷原劑量的增加，骨小梁數(shù)量顯著遞減，脂肪細胞顯著遞增。
　　4、L-DAI組大鼠骨髓細胞的ERα mRNA及蛋白表達量均顯著高于M-DAI和H-DAI組(P<0.05)，較E2、OVX和sham組增高，但差異不顯著(P>0.05)，各組ERβ mRNA及蛋白表達量均低于ERα表達

9、量，6組的ERβmRNA及蛋白表達水平未見明顯組間差異。H-DAI組大鼠骨髓細胞的PPARγ mRNA及蛋白表達水平顯著高于M-DAI和L-DAI組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、大豆苷原對骨產(chǎn)生雌激素樣作用，對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥有防治作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，低劑量時效果與雌二醇相當(dāng)，高劑量時無骨保護作用。
　　2、大鼠骨髓細胞均表達ERα和ERβ，但以ERα為主，提示ERα在骨保護作用中可能發(fā)揮主要作用

10、。
　　3、大豆苷原三個劑量組中，低劑量組大鼠骨髓細胞ERα表達顯著高于中、高劑量組，提示低劑量大豆苷原對骨的保護作用可能是通過ERα來介導(dǎo)的。高劑量組大鼠骨髓細胞PPARγ表達顯著高于中、低劑量組，提示高劑量大豆苷原可能通過作用于PPARγ，導(dǎo)致骨量減少及骨髓腔內(nèi)脂肪細胞增多。
　　4、本實驗結(jié)果顯示大豆苷原低劑量時可顯著提高血清脂聯(lián)素與瘦素水平，提示脂聯(lián)素及瘦素可能參與了對骨質(zhì)疏松癥的防治作用。
　　第二部分大豆苷

11、原對人類成骨細胞骨形成的量效作用及ERs/PPARγ的調(diào)節(jié)機制
　　目的：
　　研究不同濃度大豆苷原(daidzein，DAI)對成骨細胞骨形成的量效作用，及雌激素受體(estrogen receptors，ERs)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)對DAI骨形成的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　?、僖耘囵B(yǎng)的未經(jīng)

12、處理的人類胎兒成骨細胞(human fetal osteoblast，hFOB)為對照組(Ctrl組)，用17β-戊酸雌二醇(β-estradiol-17-valerate，E2)和不同濃度DAI分別處理hFOB72小時后，MTT法測定細胞增殖情況，PNPP法測定成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性。②用ERs拮抗劑ICI182780、ERα拮抗劑MPP、PPARγ拮抗劑GW9662分別阻斷受體ERs、ERα和PPARγ后，再給予E2及不同

13、濃度的DAI處理，MTT法檢測成骨細胞增殖情況并計算細胞增殖率，PNPP法測定ALP水平。③選用高低濃度的大豆苷原分別處理hFOB后，實時定量RT-PCR法檢測ERα、ERβ和PPARγ mRNA表達水平，western blot法檢測ERα、ERβ和PPARγ蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、隨著DAI劑量的增加，成骨細胞增殖率遞減，DAI10-9mol/L組較對照組顯著升高，DAI10-5mol/L組較對照組顯著降低(

14、P<0.05)。隨著DAI劑量的增加，成骨細胞ALP水平遞減；但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　2、ICI阻滯ERs后，E2、DAI10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L組的細胞增殖率分別為88.16％、76.30％、81.18％、83.19％，均顯著低于阻滯前(P<0.05)；MPP單純阻滯ERα后，E2、DAI10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L組的細胞增殖率分別為69.7

15、8％、63.31％、70.71％、78.43％，均顯著低于阻滯前(P<0.05)。MPP阻滯后，DAI10-9mol/L組的ALP水平顯著低于阻滯前(P<0.05)。
　　3、GW阻滯PPARγ后，E2、DAI10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L組的細胞增殖率分別是103.14％、96.99％、112.88％和122.22％，其中DAI10-7、10-5 mol/L組均較阻滯前顯著升高(P<0.05)，D9組

16、輕度降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DAI10-5 mol/L組的ALP水平較阻滯前顯著增加(P<0.05)。
　　4、E2及DAI10-9mol/L組的ERα mRNA表達量無明顯差異(P>0.05)，均顯著高于DAI10-5mol/L組(P<0.05)。DAI10-5mol/L組PPARγ mRNA表達量顯著高于E2組(P<0.05)。
　　5、與其余各組比較，DAI10-9mol/L組ERα蛋白表達水平顯著增加

17、，DAI10-5mol/L組PPARγ蛋白表達水平明顯增加。
　　6、ERβ mRNA及蛋白表達量在Ctrl、DAI10-9mol/L、DAI10-5mol/L組中均低量表達，各組間均無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1、DAI的骨保護作用具有劑量依賴性的雙相作用特點：低劑量DAI促進成骨細胞增殖和分化，高劑量DAI抑制成骨細胞增殖和分化。
　　2、低劑量DAI可能主要通過作用于ERα促進成骨細胞增殖和分化，對PPA

18、Rγ的作用不明顯。
　　3、高劑量DAI可能主要通過作用于PPARγ抑制成骨細胞增殖和分化，同時也可通過作用于ERs產(chǎn)生一定促進成骨細胞增殖的作用。
　　4、E2對PPARγ無作用；低劑量大豆苷原可能通過ERβ對成骨細胞增殖產(chǎn)生負性作用。
　　總結(jié)：
　　1、大豆苷原對骨質(zhì)疏松癥有防治作用，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，低劑量時效果明顯，高劑量無明顯作用。
　　2、低劑量大豆苷原可能主要作用于ERα，表現(xiàn)為骨生成增加