巴戟天糖鏈對(duì)ECV304細(xì)胞增殖中Bkca通道和血管生成基因譜的影響.pdf

1、我國(guó)每年死于冠心病的人數(shù)達(dá)100多萬(wàn),臨床上對(duì)冠心病-心肌梗死的治療包括應(yīng)用靶向溶栓藥物治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)(PTCA)、心臟外科體外循環(huán)等方法,這些方法可使缺血區(qū)組織及早恢復(fù)血供,有效減少梗死面積。但是,卻有相當(dāng)一部分患者不適宜用上述方法治療。如何挽救這部分患者的生命,一些學(xué)者提出了治療性血管新生的概念。近年研究也證實(shí),治療性血管新生能幫助缺血區(qū)組織建立有效的側(cè)支循環(huán),從根本上緩解心肌缺血癥狀,

2、已成為目前心血管臨床研究的熱點(diǎn)課題。巴戟天糖鏈(Morinda officinalis How oligosaccharides,MOO)是中藥巴戟天的醇提物水溶性部分中的主要有效成分,導(dǎo)師組近年來(lái)致力于巴戟天糖鏈(MOO)對(duì)心血管保護(hù)方面的研究,結(jié)果顯示,MOO能有效促進(jìn)缺血心肌血管新生,提高缺血心肌微血管密度,顯著誘導(dǎo)血管新生過(guò)程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、PDGF-B蛋白的表達(dá)。但MOO促進(jìn)血管新生中,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用

3、靶點(diǎn)及確切機(jī)制尚不明確。細(xì)胞膜上離子通道活性的改變可影響細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),進(jìn)而影響細(xì)胞增殖,大量研究證實(shí),大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)在血管平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。因此,本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304細(xì)胞)為研究材料,制作缺/復(fù)氧模型,誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,以麝香保心丸為陽(yáng)性對(duì)照藥,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖；應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),研究MOO對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中BKCa通道的影響；通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成因子基

4、因芯片高通量檢測(cè),分析在MOO影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中對(duì)血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響,從而更進(jìn)一步的探討MOO促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 觀察巴戟天糖鏈(MOO)促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖中,對(duì)BKCa通道的影響和血管生成基因譜的作用,以探討MOO促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的藥理學(xué)機(jī)制。
　　 方法：
　　 確定細(xì)胞模型條件后,對(duì)正常傳代生長(zhǎng)3～8代的ECV304細(xì)胞進(jìn)行缺氧1h、復(fù)氧2h處

5、理,然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞分為6組:正常培養(yǎng)組,缺/復(fù)氧模型組(H/R),H/R+陽(yáng)性藥物組,H/R+小劑量MOO組(50mg·L-1),H/R+中劑量MOO組(150mg·L-1),H/R+大劑量MOO組(450mg·L-1)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后:①加入胰蛋白酶(含EDTA)吹打使分散均勻,用70％乙醇固定,檢測(cè)時(shí)去除乙醇再加入RNA酶,用PI染料染色30min后進(jìn)行FCM檢測(cè)；②對(duì)細(xì)胞采用二次貼壁法處理,繼續(xù)培養(yǎng)12h后應(yīng)用全

6、細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄各組細(xì)胞中BKCa通道的電流；③加入Trizol試劑,并反復(fù)吹打使細(xì)胞均勻后,進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞血管生成基因芯片(Endothelial Cell Biology Microarray)檢測(cè)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,組間比較采用單因素方差(ANOVA)分析,以α=0.05作為顯著性差異的檢驗(yàn)水平。圖像采用Origin7.0軟件處理。
　　 結(jié)果：

7、　　 1、缺/復(fù)氧模型條件的確立
　　 用臺(tái)盼藍(lán)染色,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),計(jì)算各實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞的死亡率,并與正常培養(yǎng)細(xì)胞比較,條件為缺氧1h、復(fù)氧2h處理的細(xì)胞死亡率5.21±2.02％與正常細(xì)胞相比有顯著性差異(P<0.05)。故實(shí)驗(yàn)選擇H1R2為細(xì)胞模型制作的實(shí)驗(yàn)條件。
　　 2、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞各周期分配比例的變化
　　 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期的分配發(fā)生變化,G1期細(xì)胞所占的比例下降,G2/S％期細(xì)胞所占比例上

8、升,分別為31.44±0.42％、43.20±1.09％、46.49±1.65％、33.45±0.87％、34.43±0.66％、55.44±0.76％。以G2/S％為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),模型組與正常組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。MOO不同劑量組之間比較,差異有顯著性(P<0.05),且呈劑量依賴(lài)性。MOO大劑量組與陽(yáng)性藥物組之間比較,有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3、全細(xì)胞膜片鉗記錄各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中％通道的電流

9、　　 在+60mV指令電壓刺激下,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞BKCa通道的電流密度分別為:13.75±0.51pA/pF(n=18)、14.85±0.72pA/pF(n=7)、18.94±0.85pA/pF(n=12)、15.97±0.79pA/pF(n=11)、17.68±0.68pA/pF(n=9)、19.72±1.03pA/pF(n=15)。模型組與正常組間比較,差異有顯著性(P<0.05)。MOO不同劑量組之間比較,差異有顯著性(P<0.0

10、5),呈劑量依賴(lài)性。MOO大劑量組與陽(yáng)性藥物組之間比較,有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4、基因芯片檢測(cè)分析血管生成基因譜表達(dá)量的改變
　　 通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成基因芯片檢測(cè)了與血管生成相關(guān)的128種生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示:與模型組相比較,MOO組可上調(diào)多種促血管生成因子mRNA的表達(dá)(ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、CXCL10、FIGF1、NRP1、NRP2、PLG、PLG、LEP、PTG

11、S1、BAI1 etc)；并可下調(diào)多種抑制血管生成因子mRNA的表達(dá)(TGFB2、TNFSF15、TNFAIP2 etc)。MOO影響與血管生成相關(guān)的生長(zhǎng)因子表達(dá),促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及血管新生。
　　 結(jié)論：
　　 1 MOO能促進(jìn)缺/復(fù)氧損傷后ECV304細(xì)胞的增殖,誘發(fā)血管新生。
　　 2 MOO促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖及血管新生的作用與影響血管生長(zhǎng)相關(guān)因子mRNA的表達(dá)有關(guān)。
　　 3 MOO