夜來(lái)香生物鐘及花香基因的克隆.pdf

1、夜來(lái)香（Cestrum nocturnum）是一種茄科長(zhǎng)短日照植物，因其在夜間開(kāi)放并散發(fā)濃郁的芬芳被廣泛用于園藝裝飾，其開(kāi)花過(guò)程和夜間的香氣釋放都是源自夜來(lái)香內(nèi)源的生物節(jié)律。本研究以夜來(lái)香花瓣為材料來(lái)研究其獨(dú)特開(kāi)花習(xí)性，采用 cDNA抑制消減雜交技術(shù)，通過(guò)EST測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析，找出與夜來(lái)香生物鐘控制相關(guān)的候選差異基因，并對(duì)夜來(lái)香花香形成的代謝途徑進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；采用RT-PCR和RCAE技術(shù)相結(jié)合的方法，分離夜來(lái)香生物鐘與香氣

2、形成的相關(guān)基因（DOF、LIS、Bgl和FPPS）的全長(zhǎng)cDNA，采用染色體步移技術(shù)，克隆了DOF基因的啟動(dòng)子，并對(duì)部分基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。研究結(jié)果如下：
　　1.建立了DSN介導(dǎo)的雙鏈cDNA抑制差減雜交體系：以夜來(lái)香花瓣總RNA為材料，采用SMART兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用LA-PCR合成cDNA第二鏈作為Tester，采用含dU的LA-PCR合成cDNA第二鏈作為Driver，經(jīng)過(guò)兩輪雜交后，用DSN處理去掉

3、雙鏈cDNA，留下單鏈cDNA，然后再用過(guò)量UDG處理DSN酶切產(chǎn)物，去除Driver cDNA，最后將差異cDNA克隆后進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，最適合的DSN處理濃度為1/2 U，內(nèi)參基因β-actin的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照和1/2 DSN處理的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)也相差8個(gè)循環(huán)；由此可以初步說(shuō)明，本試驗(yàn)的抑制差減雜交效果較好；本試驗(yàn)在正向差減文庫(kù)中，獲得了551條EST，在反向文庫(kù)中獲得了44條EST，生物信息

4、學(xué)分析結(jié)果表明，夜來(lái)香的習(xí)性與生物鐘調(diào)控的次生代謝和糖代謝相關(guān)。
　　2.分離了生物鐘相關(guān)基因DOF及其啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位和表達(dá)動(dòng)態(tài)分析：以反向差減文庫(kù)中獲得的DOF基因片段為基礎(chǔ)，采用RT-PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合，獲得DOF基因的全長(zhǎng)cDNA，DOF基因的cDNA全長(zhǎng)為2087 bp，其中ORF為1530 bp，編碼510個(gè)氨基酸，在蛋白的N端有典型的Dof結(jié)構(gòu)域，并對(duì)該基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，試驗(yàn)結(jié)果表明，該基因在細(xì)

5、胞核表達(dá)；采用染色體步移技術(shù)，獲得該基因的啟動(dòng)子序列，通過(guò)在線軟件對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件分析得到大量與光反應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件如GA-motif，GAG-motif，GATA-motif，等。熒光定量PCR檢測(cè)顯示DOF基因夜間表達(dá)量顯著高于白天，推測(cè)在夜來(lái)香中DOF基因可能參與生物鐘調(diào)控過(guò)程。
　　3.分離了若干夜來(lái)香花香相關(guān)基因全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)這些基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究：本研究以夜來(lái)香開(kāi)放花瓣為材料，采用RT-PCR和RACE技術(shù)

6、相結(jié)合，獲得了不同花香代謝途徑的關(guān)鍵代謝酶基因（LIS基因、β-葡萄糖苷酶基因和FPPS基因）的全長(zhǎng)cDNA，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上，采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)這些基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明，CnLIS轉(zhuǎn)錄表達(dá)在開(kāi)始釋放香氣的時(shí)候持續(xù)上升，當(dāng)香氣消散時(shí)表達(dá)量急劇下降。表達(dá)分析顯示CnBgl表達(dá)量在白天逐漸上調(diào)，到夜晚開(kāi)始釋放香氣前急劇下調(diào)。推測(cè)在夜來(lái)香中LIS基因和Bgl基因可能參與花香調(diào)控過(guò)程。我們同樣還克隆一個(gè)FPPS基