高氧致新生大鼠CLD肺組織VEGF和PDGF表達動態(tài)變化及其對肺發(fā)育影響機制的研究.pdf

1、早產(chǎn)兒慢性肺疾病(ChronicLungDisease，CLD)是指生后28天或糾正胎齡(胎齡+日齡)36周仍需持續(xù)用氧或機械通氣，同時胸片異常者。隨著機械通氣和外源性表面活性物質(zhì)的應(yīng)用，極低出生體重兒的存活率已顯著提高。幸存者常見肺部并發(fā)癥一支氣管肺發(fā)育不良(BronchopulmonaryDysplasia，BPD)發(fā)生率也有逐年增加的趨勢，并成為新生兒重癥監(jiān)護病房(NeonatalIntensiveCareUnit，NICU)最為

2、棘手的問題之一和新生兒慢性肺疾病的最常見形式，國外CLD的發(fā)病率已達30％～40％，嚴重影響早產(chǎn)兒的存活率和生活質(zhì)量。因此，CLD的早期診治和預(yù)防已成為目前臨床上十分重要的課題。 吸入高濃度氧是引起早產(chǎn)兒CLD的主要原因之一，這在醫(yī)學(xué)界已經(jīng)得到普遍的認同。目前CLD發(fā)生機制的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點之一。既往雖然大量動物和臨床實驗從炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、氧化應(yīng)激性肺損傷和細胞外基質(zhì)沉積介導(dǎo)的肺發(fā)育障礙等多方面闡明了CLD的發(fā)生和

3、發(fā)展過程，但其確切的發(fā)生機制目前仍不明確。有關(guān)CLD的發(fā)病機制以往的報道多為肺泡化障礙的機制研究，但是肺發(fā)育包括肺泡發(fā)育和血管發(fā)育兩個方面，肺發(fā)育階段肺泡分化的同時微血管網(wǎng)同步擴展，形成有效的氣血交換屏障。肺血管形成的途徑至少有兩種：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是由間質(zhì)成血細胞分化形成血管的過程；血管生成是由已存在血管以出芽的方式形成新生血管的過程。調(diào)節(jié)肺血管發(fā)育的因子有多種，其中最重要的有誘導(dǎo)血管生長的血管內(nèi)皮生長因子(Vascula

4、rendothelialgrowthfactor，VEGF)；抑制血管生長的有內(nèi)皮抑素(Endostatin)。調(diào)節(jié)肺發(fā)育的因子有多種，其中最重要的有血小板源性生長因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)。 VEGF在肺中對內(nèi)皮細胞起著遷徙、存活和分化因子的作用，是肺發(fā)育的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。動物實驗表明：在肺發(fā)育受損期，VEGF顯著減少，恢復(fù)期，伴隨著正常肺發(fā)育的重建，VEGF上調(diào)。以后進展為B

5、PD的早產(chǎn)兒較恢復(fù)期新生兒VEGF降低。Bhatt對BPD死亡嬰兒尸檢發(fā)現(xiàn)，肺組織中內(nèi)皮細胞標(biāo)記物PECAM-1蛋白和mRNA減少，VEGFmRNA及其受體Flt-1也顯著減少，認為異常肺血管生成可能是BPD的一個重要因素。Endostatin是由多種蛋白酶水解膠原蛋白ⅩⅧ而產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的蛋白。它在多種層次研究水平上都可抑制新血管生成。PDGF-A和PDGF-B分別與其特異高親和性受體PDGFR-α和PDGFR-β結(jié)合，對肺發(fā)育

6、起著重要的作用。有關(guān)VEGF、Endostatin、PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α和PDGFR-β在CLD中的動態(tài)變化，目前還缺乏系統(tǒng)研究。 本研究根據(jù)新生大鼠肺泡的發(fā)育階段、時間順序與人類肺發(fā)育相似這一特點，給新生Wistar大鼠持續(xù)吸入高氧制作CLD動物模型；應(yīng)用組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，動態(tài)觀察新生大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)演變規(guī)律；分別從蛋白及分子水平上觀察肺組織中VEGF、Endostatin、P

7、DGF和PDGFRs在CLD中的動態(tài)變化規(guī)律及其在CLD發(fā)病過程中可能的作用，試圖闡明高氧CLD肺發(fā)育的異常改變及其發(fā)生機制。從而為完善早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生機制及尋求有效的防治途徑奠定實驗基礎(chǔ)。 材料與方法:一、動物模型高氧組將足月新生大鼠(連同母鼠)生后12h內(nèi)置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2在0.90～0.95(美國OM-25ME型測氧儀監(jiān)測)，用鈉石灰吸收CO2，使其濃度＜0.5％(Dapex氣體分析儀)，箱內(nèi)溫度24

8、～26℃，濕度60～70％，每天定時開箱0.5h，稱重，添加水及飼料，更換墊料，觀察新生鼠的一般情況，與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護理能力降低；空氣組置于空氣中(FiO20.21)，環(huán)境溫度、濕度等控制因素與高氧組相同。 二、實驗標(biāo)本采集及處理于實驗后1d、3d、7d、14d和21d分別從兩組中隨機抽取，麻醉后，立即打開胸腔，分離肺組織，按以下方式分別保存： 1.取左肺置于0.1％DEPC的4％多聚甲醛(0.1

9、MPBS，PH7.0～7.6)中固定，24h內(nèi)常規(guī)脫水及石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色和病理形態(tài)學(xué)觀察。 2.取右肺上葉置于2.5％戊二醛中固定，用于透射電鏡觀察肺血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)。 3.于無菌條件下取材，取右肺其余各葉置于元Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中冷凍保存，用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR)和Wes

10、ternblotting檢測。 三、實驗方法及檢測指標(biāo)(一)病理形態(tài)學(xué)研究1.光鏡觀察：切片進行常規(guī)HE染色，光鏡下動態(tài)觀察肺組織的病理改變。 2.放射狀肺泡計數(shù)(RAC)評估肺發(fā)育程度。 3.透射電鏡觀察：高氧致新生鼠肺血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 (二)免疫組織化學(xué)技術(shù)(SABC法)檢測肺組織VEGF、PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α和PDGFR-β蛋白質(zhì)表達。 每個時間點隨機抽取染

11、色清晰的切片5張，每張切片于光鏡下(×400)隨機選取5個視野，固定窗口面積，其蛋白的半定量測定利用美國(MetaMorph/C-5050/Bx41(UIC/OLYMPUS，US/JP)顯微圖象分析處理系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進行處理，著色強度以光密度(OD)表示。 3.WesternBlotting法檢測肺組織Endostatin、PDGF-A和PDGF-B蛋白質(zhì)表達的動態(tài)改變。 (三)RT-PCR技術(shù)檢測肺組織VE

12、GF、PDGF-A、PDGF-BmRNA的表達并半定量擴增產(chǎn)物分析：2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后紫外燈下觀察RT-PCR擴增產(chǎn)物并拍照，用Kodak1D型凝膠成像及分析系統(tǒng)進行電泳條帶分析。目標(biāo)產(chǎn)物mRNA表達水平以它們與B-actin的相對表達量來計算。 四、統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準差(-x±s)表示，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對t檢驗進行組間差異性分析，以P＜0.05為有顯著性差異判斷標(biāo)

13、準。 結(jié)論:1.新生大鼠生后持續(xù)吸入高濃度氧21天，引起肺組織損傷，表現(xiàn)：早期為炎性滲出，出血；晚期引起肺泡發(fā)育障礙，正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔直徑明顯增大，肺泡數(shù)量明顯減少，肺泡間隔菲薄，大量肺間質(zhì)細胞增生，符合早產(chǎn)兒CLD的病理改變。 2.高氧導(dǎo)致新生大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞破壞，提示高氧損傷肺血管發(fā)育過程，因此導(dǎo)致肺發(fā)育障礙。 3.高氧導(dǎo)致新生大鼠肺組織VEGF的表達減少。正常新生大鼠肺組織Endostatin存

14、在一定量的基礎(chǔ)表達，高氧導(dǎo)致Endostatin的表達明顯降低。 4.肺血管的生長是正常肺發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，推測血管生長因子的改變可能是高氧引起肺微血管發(fā)育障礙的機制之一。 5.PDGF-A是生后2周內(nèi)肺泡形成的關(guān)鍵因子，高氧抑制PDGF-A生成，導(dǎo)致肺分支阻滯和肺分隔減少，肺泡數(shù)目減少，提示PDGF-A參與了高氧致CLD的肺發(fā)育障礙過程。 6.PDGF-B在生后肺質(zhì)量增長中起關(guān)鍵作用，高氧誘導(dǎo)PDGF-B過度表達