高氧致新生大鼠CLD肺組織VEGF和PDGF表達(dá)動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)肺發(fā)育影響機(jī)制的研究.pdf

1、早產(chǎn)兒慢性肺疾病(ChronicLungDisease，CLD)是指生后28天或糾正胎齡(胎齡+日齡)36周仍需持續(xù)用氧或機(jī)械通氣，同時(shí)胸片異常者。隨著機(jī)械通氣和外源性表面活性物質(zhì)的應(yīng)用，極低出生體重兒的存活率已顯著提高。幸存者常見(jiàn)肺部并發(fā)癥一支氣管肺發(fā)育不良(BronchopulmonaryDysplasia，BPD)發(fā)生率也有逐年增加的趨勢(shì)，并成為新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NeonatalIntensiveCareUnit，NICU)最為

2、棘手的問(wèn)題之一和新生兒慢性肺疾病的最常見(jiàn)形式，國(guó)外CLD的發(fā)病率已達(dá)30％～40％，嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的存活率和生活質(zhì)量。因此，CLD的早期診治和預(yù)防已成為目前臨床上十分重要的課題。 吸入高濃度氧是引起早產(chǎn)兒CLD的主要原因之一，這在醫(yī)學(xué)界已經(jīng)得到普遍的認(rèn)同。目前CLD發(fā)生機(jī)制的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。既往雖然大量動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)從炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激性肺損傷和細(xì)胞外基質(zhì)沉積介導(dǎo)的肺發(fā)育障礙等多方面闡明了CLD的發(fā)生和

3、發(fā)展過(guò)程，但其確切的發(fā)生機(jī)制目前仍不明確。有關(guān)CLD的發(fā)病機(jī)制以往的報(bào)道多為肺泡化障礙的機(jī)制研究，但是肺發(fā)育包括肺泡發(fā)育和血管發(fā)育兩個(gè)方面，肺發(fā)育階段肺泡分化的同時(shí)微血管網(wǎng)同步擴(kuò)展，形成有效的氣血交換屏障。肺血管形成的途徑至少有兩種：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是由間質(zhì)成血細(xì)胞分化形成血管的過(guò)程；血管生成是由已存在血管以出芽的方式形成新生血管的過(guò)程。調(diào)節(jié)肺血管發(fā)育的因子有多種，其中最重要的有誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascula

4、rendothelialgrowthfactor，VEGF)；抑制血管生長(zhǎng)的有內(nèi)皮抑素(Endostatin)。調(diào)節(jié)肺發(fā)育的因子有多種，其中最重要的有血小板源性生長(zhǎng)因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)。 VEGF在肺中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起著遷徙、存活和分化因子的作用，是肺發(fā)育的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：在肺發(fā)育受損期，VEGF顯著減少，恢復(fù)期，伴隨著正常肺發(fā)育的重建，VEGF上調(diào)。以后進(jìn)展為B

5、PD的早產(chǎn)兒較恢復(fù)期新生兒VEGF降低。Bhatt對(duì)BPD死亡嬰兒尸檢發(fā)現(xiàn)，肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物PECAM-1蛋白和mRNA減少，VEGFmRNA及其受體Flt-1也顯著減少，認(rèn)為異常肺血管生成可能是BPD的一個(gè)重要因素。Endostatin是由多種蛋白酶水解膠原蛋白ⅩⅧ而產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的蛋白。它在多種層次研究水平上都可抑制新血管生成。PDGF-A和PDGF-B分別與其特異高親和性受體PDGFR-α和PDGFR-β結(jié)合，對(duì)肺發(fā)育

6、起著重要的作用。有關(guān)VEGF、Endostatin、PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α和PDGFR-β在CLD中的動(dòng)態(tài)變化，目前還缺乏系統(tǒng)研究。 本研究根據(jù)新生大鼠肺泡的發(fā)育階段、時(shí)間順序與人類(lèi)肺發(fā)育相似這一特點(diǎn)，給新生Wistar大鼠持續(xù)吸入高氧制作CLD動(dòng)物模型；應(yīng)用組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，動(dòng)態(tài)觀察新生大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)演變規(guī)律；分別從蛋白及分子水平上觀察肺組織中VEGF、Endostatin、P

7、DGF和PDGFRs在CLD中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其在CLD發(fā)病過(guò)程中可能的作用，試圖闡明高氧CLD肺發(fā)育的異常改變及其發(fā)生機(jī)制。從而為完善早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生機(jī)制及尋求有效的防治途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法:一、動(dòng)物模型高氧組將足月新生大鼠(連同母鼠)生后12h內(nèi)置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2在0.90～0.95(美國(guó)OM-25ME型測(cè)氧儀監(jiān)測(cè))，用鈉石灰吸收CO2，使其濃度＜0.5％(Dapex氣體分析儀)，箱內(nèi)溫度24

8、～26℃，濕度60～70％，每天定時(shí)開(kāi)箱0.5h，稱(chēng)重，添加水及飼料，更換墊料，觀察新生鼠的一般情況，與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護(hù)理能力降低；空氣組置于空氣中(FiO20.21)，環(huán)境溫度、濕度等控制因素與高氧組相同。 二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理于實(shí)驗(yàn)后1d、3d、7d、14d和21d分別從兩組中隨機(jī)抽取，麻醉后，立即打開(kāi)胸腔，分離肺組織，按以下方式分別保存： 1.取左肺置于0.1％DEPC的4％多聚甲醛(0.1

9、MPBS，PH7.0～7.6)中固定，24h內(nèi)常規(guī)脫水及石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色和病理形態(tài)學(xué)觀察。 2.取右肺上葉置于2.5％戊二醛中固定，用于透射電鏡觀察肺血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 3.于無(wú)菌條件下取材，取右肺其余各葉置于元Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中冷凍保存，用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR)和Wes

10、ternblotting檢測(cè)。 三、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)(一)病理形態(tài)學(xué)研究1.光鏡觀察：切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察肺組織的病理改變。 2.放射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)評(píng)估肺發(fā)育程度。 3.透射電鏡觀察：高氧致新生鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 (二)免疫組織化學(xué)技術(shù)(SABC法)檢測(cè)肺組織VEGF、PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α和PDGFR-β蛋白質(zhì)表達(dá)。 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取染

11、色清晰的切片5張，每張切片于光鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野，固定窗口面積，其蛋白的半定量測(cè)定利用美國(guó)(MetaMorph/C-5050/Bx41(UIC/OLYMPUS，US/JP)顯微圖象分析處理系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行處理，著色強(qiáng)度以光密度(OD)表示。 3.WesternBlotting法檢測(cè)肺組織Endostatin、PDGF-A和PDGF-B蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變。 (三)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織VE

12、GF、PDGF-A、PDGF-BmRNA的表達(dá)并半定量擴(kuò)增產(chǎn)物分析：2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后紫外燈下觀察RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并拍照，用Kodak1D型凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶分析。目標(biāo)產(chǎn)物mRNA表達(dá)水平以它們與B-actin的相對(duì)表達(dá)量來(lái)計(jì)算。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異性分析，以P＜0.05為有顯著性差異判斷標(biāo)

13、準(zhǔn)。 結(jié)論:1.新生大鼠生后持續(xù)吸入高濃度氧21天，引起肺組織損傷，表現(xiàn)：早期為炎性滲出，出血；晚期引起肺泡發(fā)育障礙，正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔直徑明顯增大，肺泡數(shù)量明顯減少，肺泡間隔菲薄，大量肺間質(zhì)細(xì)胞增生，符合早產(chǎn)兒CLD的病理改變。 2.高氧導(dǎo)致新生大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞，提示高氧損傷肺血管發(fā)育過(guò)程，因此導(dǎo)致肺發(fā)育障礙。 3.高氧導(dǎo)致新生大鼠肺組織VEGF的表達(dá)減少。正常新生大鼠肺組織Endostatin存

14、在一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，高氧導(dǎo)致Endostatin的表達(dá)明顯降低。 4.肺血管的生長(zhǎng)是正常肺發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，推測(cè)血管生長(zhǎng)因子的改變可能是高氧引起肺微血管發(fā)育障礙的機(jī)制之一。 5.PDGF-A是生后2周內(nèi)肺泡形成的關(guān)鍵因子，高氧抑制PDGF-A生成，導(dǎo)致肺分支阻滯和肺分隔減少，肺泡數(shù)目減少，提示PDGF-A參與了高氧致CLD的肺發(fā)育障礙過(guò)程。 6.PDGF-B在生后肺質(zhì)量增長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用，高氧誘導(dǎo)PDGF-B過(guò)度表達(dá)