新生鼠高氧肺損傷NF-κB、TNFα和IL-8表達的動態(tài)變化.pdf

1、二十世紀九十年代以來，，隨著NICU的建立，機械通氣和表面活性物質(zhì)的普遍應用及早產(chǎn)兒治療水平的提高，早產(chǎn)兒存活率大大提高，CLD的發(fā)病率也呈不斷增加的趨勢，嚴重影響了早產(chǎn)兒的生活質(zhì)量。CLD是當前新生兒重癥監(jiān)護室中常見的并發(fā)癥，加強對本病的研究，對提高早產(chǎn)兒的存活率和改善早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量有著重要的意義。高氧肺損傷后，動物在臨床病理生理和肺形態(tài)學改變上與早產(chǎn)兒長時間使用正壓通氣和高氧肺損傷后導致的CLD非常相似，因而大多數(shù)學者利用高氧肺損

2、傷動物模型來研究CLD。目前，CLD詳盡的發(fā)病機制尚未清楚，CLD的發(fā)生與肺發(fā)育不成熟、氧療和機械通氣、炎癥反應、細胞凋亡及組織異常修復有關。國內(nèi)外的研究表明，新生兒長期吸入高濃度的氧氣，肺部出現(xiàn)以炎癥和纖維化為主要特征的急慢性肺損傷，是導致CLD的主要危險因素之一。炎癥是CLD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，在CLD發(fā)病的早期，有炎癥細胞的聚集和可溶性炎性介質(zhì)的釋放，這些因素在后續(xù)的肺組織破壞、修復和增生過程中起著至關重要的作用。高氧可誘導肺中多種細

3、胞因子的表達，如IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6和TGFβ均參與了此過程，其確切機制尚不清楚，這些細胞因子相互作用、相互誘生，構成一個復雜的作用網(wǎng)絡。NF-κB可調(diào)控與炎癥反應和免疫反應有關的許多細胞因子及黏附分子基因的表達。 本實驗采用常壓高濃度氧(高氧)建立新生鼠CLD模型，觀察肺組織的病理改變及肺組織中NF-κB、TNFα、IL-8的動態(tài)變化，探討NF-κB活化與細胞因子在高氧肺損傷中的作用機制，為臨床CLD的治

4、療提供理論依據(jù)和實踐方向。 材料與方法 1.研究對象新生昆明小鼠80只(10窩，每窩8只)。 2.動物模型的建立及動物分組新生小鼠隨機分為實驗組與對照組，每組為5窩。實驗組將新生昆明小鼠置于密閉箱中持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2＞0.90,CO2＜0.5，溫度22℃-27℃，濕度50％-70％，每天及時添加水，飼料及更換墊料；對照組：FiO2=0.21，溫度、濕度控制同實驗組。 3.標本采集及處理每組小鼠分別

5、于實驗后的1、3、7、14、21天處死，取左肺置于10％福爾馬林中固定，制備石蠟切片，右肺制備肺組織勻漿，離心后取上清待測。 4.實驗方法及檢測指標石蠟切片HE染色光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學變化；SABC免疫組化檢測肺組織中NF-κBp65、TNFα的表達，ELISA檢測肺組織IL-8。 5統(tǒng)計學分析所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因

6、素方差分析，顯著性水平為α=0.05。 結(jié)果 1.肺組織的病理改變對照組出生后肺泡上皮自不規(guī)則結(jié)構逐漸發(fā)育成熟，至21天肺泡結(jié)構規(guī)整，肺泡大小均勻一致，肺泡間隔變薄。實驗組1天表現(xiàn)為肺泡樣結(jié)構不規(guī)則，肺泡腔較小，肺泡間隔較厚，與對照組無明顯差別；3天時肺泡結(jié)構逐漸規(guī)整，大小較均勻，肺泡間隔變薄，肺泡腔內(nèi)及肺泡間隔有少許炎性細胞滲出；7天時肺泡腔增大，肺泡間隔較薄，14天時肺泡腔明顯增大，肺泡數(shù)量減少，21天時正常肺泡結(jié)構

7、消失，數(shù)量明顯減少，肺泡腔直徑明顯增大，肺泡間隔菲薄，局部肺間質(zhì)細胞增加。 2.肺組織NF-κBp65的表達：免疫組化顯示NF-κBp65蛋白在對照組小鼠肺組織呈陰性或弱陽性反應，部分胞漿呈淺染色，偶見胞核著色；實驗組與對照組相比，各時間點均呈強陽性反應，陽性反應產(chǎn)物不僅分布于陽性細胞的胞漿中，細胞核中也呈強陽性反應，表達分布更廣泛，NF-κBp65蛋白在實驗組各個時間點表達水平不同，實驗組1天時NF-κBp65蛋白表達陽性率為

8、(3.08±0.38)％，高于對照組的(2.73±0.42)％，但差異沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。實驗組在3天、7天、14天、21天的NF-κBp65蛋白表達陽性率分別為(14.42±1.12)％、(7.52±0.55)％、(24.30±0.96)％、(10.88±0.76)％，明顯高于對照組的(4.75±0.40)％、(4.76±0.40)％、(5.50±0.52)％、(5.63±0.46)％，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)

9、。14天表達水平最高，其次為3天。實驗組3天、7天、14天、21天分別與實驗組1天比較差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。 3.肺組織TNFα的表達：免疫組化顯示TNFα蛋白在對照組小鼠肺組織呈陰性或弱陽性反應；實驗組與對照組相比，各時間點均呈強陽性反應，表達分布廣泛。對照組均呈低水平表達，1天、3天、7天、14天、21天分別為：(3.03±0.51)％、(3.16±0.27)％、(3.66±0.30)％、(6.53±0.41

10、)％、(5.88±0.46)％。各實驗組與對照組比較TNFα的表達均具有顯著性差異(p＜0.05)，實驗組1天時為(11.06±1.01)％，隨之TNFα蛋白表達水平進行性升高，，3天時為(41.44±2.23)％、7天時達高峰(60.22±2.85)％，以后TNFα蛋白表達水平逐漸下降，14天為(35.18±1.41)％，至21天為(16.83±0.89)％，仍高于對照組，未能完全恢復正常。實驗組3天、7天、14天、21天分別與實驗組

11、1天比較TNFα的表達均具有顯著性差異(p＜0.05)。 4.肺組織IL-8的表達：實驗組肺組織IL-8水平均高于對照組，實驗組1天為(63.96±5.40)pg/ml,與對照組1天的(53.39±9.76)pg/ml比較差異沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；隨吸氧時間延長，實驗組肺組織IL-8水平進行性升高并一直持續(xù)至21天，實驗組3天、7天、14天、21天分別為(108.17±8.92)pg/ml、(129.14±6.49)p

12、g/ml、(161.80±11.11)pg/ml、(235.35±31.60)pg/ml，明顯高于對照組的(85.40±8.40)pg/ml、(94.24±5.20)pg/ml、(104.03±4.14)pg/ml、(116.71±5.29)pg/ml，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。實驗組3天、7天、14天、21天分別與實驗組1天比較IL-8的表達均具有顯著性差異(p＜0.05)。 結(jié)論 1.本研究建立的新生鼠高

13、氧肺損傷模型是成功的，高氧可造成新生鼠肺組織明顯的病理損傷，隨著吸氧時間的延長，其病理損傷逐漸加重。 2.高氧暴露后新生鼠肺組織NF-κB活化并持續(xù)表達，提示NF-κB活化在高氧肺損傷的發(fā)生、發(fā)展中起作用。 3.高氧暴露早期TNFα隨暴露時間的延長而增加，繼續(xù)暴露時則逐漸降低，提示TNFα主要在早期的急性炎癥階段起作用，而在后期的纖維化病變中所起的單獨作用相對較弱。 4.IL-8的水平升高貫穿于高氧暴露的病程中，