高氧致CLD新生鼠肺泡上皮細(xì)胞AQP、SP、Occludin表達(dá)的動態(tài)變化及其影響作用的研究.pdf

1、臨床研究表明，高氧肺損傷已成為危重新生兒救治的主要并發(fā)癥之一，甚至可能發(fā)展為嚴(yán)重的后遺癥—慢性肺疾病(chroniclungdisease，CLD)。 目前，CLD的病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，現(xiàn)研究認(rèn)為，肺發(fā)育不成熟、氧中毒、高氣壓或容量傷、感染等因素是CLD發(fā)生的重要因素。 肺內(nèi)正常的解剖結(jié)構(gòu)和生理機(jī)制保持著肺間質(zhì)的水分恒定和肺泡處于理想的濕潤狀態(tài)，以利于完成肺的各種功能。如果某些原因引起肺血管外液體量過度增多甚至滲

2、入肺泡，則引起生理功能紊亂，即稱為肺水腫。 Carter發(fā)現(xiàn)鼠暴露于高氧環(huán)境中60h后，造成肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮損傷，出現(xiàn)肺水腫。2002年Matthay等的研究表明，急性肺損傷后肺泡上皮屏障功能變化與肺水腫的產(chǎn)生和發(fā)展更為相關(guān)。在致傷因素作用下，肺泡上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞間連接破壞，上皮通透性增加，液體漏入肺泡腔；同時肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)能受損，肺泡內(nèi)液體清除障礙，造成肺泡性肺水腫。Mat-thay認(rèn)為肺泡上皮屏障功能在急性肺損傷發(fā)

3、病機(jī)制中占中心地位，肺泡上皮屏障損傷的程度決定了急性肺損傷病人的傷情，而上皮屏障功能恢復(fù)的情況則決定了病人的預(yù)后。肺泡上皮屏障由Ⅰ型(AECⅠ)和Ⅱ型細(xì)胞(AE-CⅡ)及細(xì)胞間連接組成。 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AECⅡ)是胚肺主要干細(xì)胞，肺損傷修復(fù)的重要途徑是增殖并向肺泡Ⅰ型細(xì)胞分化，對肺泡壁重新上皮化以恢復(fù)氣血屏障起重要作用。表面活性物質(zhì)(Surfactantprotein，SPs)主要由AECⅡ合成并分泌，它們具有廣泛的生物效應(yīng)

4、，降低肺表面張力促進(jìn)液體吸收、防止發(fā)生肺泡塌陷、肺水腫，保持呼氣末肺泡擴(kuò)張狀態(tài)，維持肺泡正常大小發(fā)揮重要作用。它們在高氧肺損傷中的表達(dá)及其信號調(diào)控機(jī)制的研究少見報道。 水通道蛋白(aquaporin，AQP)是新近發(fā)現(xiàn)的一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的發(fā)現(xiàn)在分子水平上揭示了水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)機(jī)制。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：AQP1、AQP5敲除鼠的肺泡水滲透力降低10倍；Towre發(fā)現(xiàn)小鼠在腺病毒感染后AQP1、AQP5明顯下降，AQ

5、P1、AQP5不但表達(dá)于肺部感染部位，而且表達(dá)于全肺，這是首次研究顯示與肺部感染、水腫有關(guān)，AQP1、AQP5參與肺部感染時異常液體的流動；內(nèi)毒素急性肺損傷模型中肺水腫時AQP1、AQP5表達(dá)均下調(diào)；有動物實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)鼠高氧(FiO20.9)暴露7天AQP表達(dá)降低，第14天明顯降低。是否高氧刺激早期就存在AQP1、AQP5表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致水的異常跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和水在肺組織的異常積聚進(jìn)而導(dǎo)致肺損傷?AQP的信號調(diào)控機(jī)制?目前尚不清楚。 目

6、前學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，高氧肺損傷后肺泡上皮屏障功能變化與肺水腫的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)。在高氧因素作用下，肺泡上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞間連接破壞，上皮通透性增加，液體漏入肺泡腔。雖然肺泡上皮屏障功能在急性肺損傷發(fā)病機(jī)制中占有中心地位，但肺泡上皮緊密連接的損傷及其調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍缺乏研究。 本研究以高氧致新生鼠CLD模型為對象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，動態(tài)觀察高氧肺損傷早期肺泡上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)演變規(guī)律；研究肺組織中肺泡上皮屏障功能的動態(tài)變

7、化；從分子生物學(xué)水平上觀察肺組織中AQP、SP、Occludin的動態(tài)變化規(guī)律并對其可能的下游信號途徑進(jìn)行了初步研究；初步探索了高氧致肺損傷早期肺水腫機(jī)制，從而為完善新生兒CLD發(fā)生機(jī)制尋求有效的防治途徑奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。 材料與方法一、動物模型孕21d-23d自然分娩的新生鼠生后12h內(nèi)(0d)依據(jù)吸氧濃度(FiO2)隨機(jī)分組：實(shí)驗組1(FiO20.8)、實(shí)驗組2(FiO20.6)、實(shí)驗組3(FiO20.4)。對照組(FiO20.

8、21)。高氧組置于氧箱(有機(jī)玻璃箱)中，持續(xù)吸人氧氣，氧濃度分別維持在80％、60％、40％，每日用數(shù)字式測氧儀監(jiān)測(美國OM-25ME)，用鈉石灰吸收CO2，使其濃度小于0.5％，溫度25-26℃，濕度60％-70％，每天開箱0.5h，喂水及飼料，更換墊料，做處置，每天將母鼠與吸空氣母鼠互換以避免代母鼠因氧中毒而致護(hù)理能力降低；空氣對照組置于空氣中(氧濃度0.21)，飼養(yǎng)條件與高氧組相同。 二、實(shí)驗標(biāo)本采集及處理每組分別于實(shí)驗

9、后1、3、5、7、14d隨機(jī)選取8只鼠，處死后無菌取肺組織，用于肺形態(tài)學(xué)觀察免疫組織化學(xué)檢測的標(biāo)本置于4％多聚甲醛中固定；用于超微結(jié)構(gòu)觀察的標(biāo)本置于2.5％戊二醛中固定；用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerizechainreaction，RT-PCR)和WesternBlotting檢測的標(biāo)本置于Eppendorf管內(nèi)，于-80℃冰箱中凍存。 三、實(shí)驗方法1.光鏡觀察：①肺組織病理改變

10、②肺泡間隔寬度(美國UniversalImagingPorporation圖像分析系統(tǒng))③放射狀肺泡計數(shù)(radicalalveolarcounts，RAC)。 2.透射電鏡觀察AEC1I超微結(jié)構(gòu)改變，硝酸鑭示蹤技術(shù)觀察肺泡屏障功能的改變。 3.檢測肺濕/干重比值(W/D)；BALF中蛋白含量的動態(tài)變化，應(yīng)用紫外/可見分光光度計；Evans藍(lán)檢測肺泡上皮通透性(AEP)。 4.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化

11、因子3(signaltransducersandactivatorsoftransduction3，STAT3)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinane，ERKl/2)、水通道蛋白1(aquaporinl，AQP1)、水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)、血小板源性生長因子A(Platelet-derivedgrowthfactorA，PDGFA)血小板源性生長因子B(Pla

12、telet-derivedgrowthfactorB，PDGFB)血小板源性生長因子受體α(plateletderivedgrowthfactorreceptorα，PDGFRα)血小板源性生長因子受體β(plateletderivedgrowthfactorreceptorβ，PDGFRβ)。 5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerisechainreaction，RT-PCR)技術(shù)檢測

13、表面活性物質(zhì)蛋白質(zhì)(surfacantproteins，SPs)、AQP1、AQP5、緊密連接蛋白(occludin)mRNA的動態(tài)表達(dá)。 6.WesternBlotting法檢測肺組織AQP1、AQP5蛋白表達(dá)的動態(tài)變化。 四、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以-x±s表示，單因素多水平比較采用OneWayANOVA分析，相關(guān)分析采用Spearman分析。 結(jié)論1.高氧誘導(dǎo)的新生

14、大鼠CLD模型改變符合早產(chǎn)兒CLD發(fā)生、發(fā)展特點(diǎn)和組織病理學(xué)的改變。 2.高氧肺損傷早期存在肺泡上皮通透性增加導(dǎo)致的肺水腫改變；新生鼠隨著高氧暴露的濃度增高和時間的延長，肺損傷加重。 3.高氧肺損傷的早期伴隨有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)JAKs-STAT3通路的激活來發(fā)揮其對肺組織的保護(hù)作用，SPB合成、分泌信號可能是STAT3途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的。 4.AQP1和AQP5的蛋白表達(dá)和基因水平的動態(tài)變化揭示：AQP1、AQP5在高氧肺損傷時