siRNA抑制ZNF139對人胃癌裸鼠原位移植瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:胃癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，居消化系統(tǒng)惡性腫瘤首位。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)ZNF139的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖凋亡等密切相關(guān)，本實驗以胃癌SGC7901細(xì)胞原位移裸鼠模型為對象，通過熒光雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究抑制ZNF139對胃癌的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的影響，為ZNF139參與胃癌轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.合成針對Z

2、NF139的小干擾RNA（siRNA-ZNF139），以siRNA-ZNF139質(zhì)粒對胃癌細(xì)胞系SGC7901（中分化腺癌）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后用G418篩選。
　　 體外培養(yǎng)對數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞，以siRNA-ZNF139質(zhì)粒對其進(jìn)行干擾，qRT-PCR檢測不同濃度siRNA-ZNF139干擾質(zhì)粒抑制率，使用G418對干擾后細(xì)胞株進(jìn)行篩選，得到最適濃度干擾細(xì)胞系。
　　 2.建立人胃癌原位移植裸鼠模型
　

3、　 體外收集經(jīng)G418篩選siRNA-ZNF139質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞、陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞及普通SGC-7901細(xì)胞，接種至裸鼠皮下，皮下瘤鼠間傳代5次。將第六代皮下瘤剪成約1mm3大小瘤塊，用OB生物膠粘貼法進(jìn)行裸鼠原位移植。成瘤后每4天測量原位瘤長短徑，待直徑約1.0cm左右時，脫頸處死裸鼠，取出原位移植瘤、腹腔腫大淋巴結(jié)。每個標(biāo)本一分為三，兩份迅速置液氮灌中保存，一份用福爾馬林固定送病理檢查。
　　 3.應(yīng)用熒光雙向差異凝

4、膠電泳(2D-DIGE)技術(shù)分別分離siRNA-ZNF139干擾前后胃原位移植瘤及腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)蛋白質(zhì)，選定差異點(diǎn)后，用Ettanspotpicker挖取，并行膠內(nèi)酶解，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)質(zhì)譜鑒定技術(shù)對挖取的蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定，并對鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。
　　 4.應(yīng)用Westernblot方法驗證裸鼠原位移植瘤組織及腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中差異蛋白質(zhì)的表達(dá)，檢測是否與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 結(jié)果:
　　 1.s

5、iRNA-ZNF139質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞后ZNF139mRNA表達(dá)的變化
　　 qRT-PCR檢測顯示在0μg/μl、0.4μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl、1.0μg/μl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的SGC7901細(xì)胞中ZNF139mRNA相對表達(dá)量分別為1.0020±0.0765,0.6788±0.1032,0.3691±0.0242,0.1711±0.0133,0.2880±0.0506，統(tǒng)計分析顯示各組有顯

6、著差異(P＜0.01)，其中以0.8μg/μl組抑制效率最高，為82.92％。
　　 2.siRNA抑制ZNF139表達(dá)后裸鼠原位移植瘤的形態(tài)觀察
　　 皮下移植瘤經(jīng)6次鼠間傳代后，待直徑約1.0cm左右時取出，用OB生物膠粘貼法進(jìn)行原位移植，一周后空白組和陰性組裸鼠均可觸及腹部腫瘤，兩周左右siRNA-ZNF139組裸鼠可觸腹部移植瘤，之后瘤體不斷增大。每4天測量其最長徑與最短徑，并按照V=ab2/2（a為長徑，b為短

7、徑）計算移植留瘤體積?？瞻捉M比陰性組原位移植瘤瘤略大，沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，與陰性組及空白組比較，實驗組原位移植瘤瘤生長明顯減慢(P＜0.05)。15只裸鼠原位移植瘤經(jīng)HE染色組織病理學(xué)檢查均證實為胃癌，原位成瘤率100％。
　　 3.siRNA抑制ZNF139對裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)生長的影響
　　 空白組、陰性組及實驗組裸鼠腹腔均可見腫大淋巴結(jié)，每組各取5枚陽性淋巴結(jié)，其中空白組腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率36.67％，陰

8、性組腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率63.33％，實驗組腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為66.67％?？瞻捉M與陰性組比較，腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與空白組及陰性組相比較，實驗組腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.蛋白質(zhì)樣品完整性的檢測
　　 提取原位移植瘤及腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)蛋白質(zhì)，SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍(lán)染色顯示，原位移植瘤蛋白及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)蛋白無明顯降解，蛋白質(zhì)完整性良好，實驗組和

9、對照組蛋白質(zhì)在PAGE上差別不明顯。
　　 5.2D-DIGE和LC-MS結(jié)果
　　 原位移植瘤2D-DIGE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)為7658±47個，匹配率為91.6％，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)2D-DIGE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)為3117±82，匹配率為92.5％，說明雙向電泳技術(shù)具有較高的重復(fù)性。應(yīng)用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware在原位移植瘤中選取9個差異明顯的蛋白點(diǎn)，并用Ettanspotpicker系

10、統(tǒng)進(jìn)行挖點(diǎn)。經(jīng)LC-MS鑒定出出5種蛋白質(zhì)(Fascin、ANXA1、hnRNPA2/B1、glutaminesynthetase、carbonicanhydrase3)，篩選后經(jīng)功能分析確定3種可能與胃癌有關(guān)的蛋白質(zhì)即Fascin、ANXA1、hnRNPA2/B1，其中Fascin、hnRNPA2/B1在siRNA-ZNF139組的胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，ANXA1表達(dá)上調(diào)。在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)選取5個差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)LC-MS鑒定出3種蛋白質(zhì)(t

11、rypsin-1、desmin、ANXA5)，經(jīng)功能分析確定1種可能與胃癌有關(guān)的蛋白質(zhì)即ANXA5，ANXA5在siRNA-ZNF139組的胃癌組織中表達(dá)下調(diào)。
　　 6.應(yīng)用Westernblot法對各實驗裸鼠原位移植瘤組織中Fascin、ANXA1、hnRNPA2/B1及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ANXA5分別和ZNF139的表達(dá)進(jìn)行了驗證。統(tǒng)計學(xué)分析表明，與對照組相比，原位移植瘤中siRNA-ZNF139組的Fascin、hnRNPA2

12、/B1、ZNF139表達(dá)量顯著降低，而ANXA1表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）。在腹腔淋巴結(jié)中與對照組相比siRNA-ZNF139組ANXA5表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01），與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.人胃癌裸鼠原位移植模型可近似模擬人胃癌在體內(nèi)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行。建立操作簡單且成瘤率高，是目前較理想的研究胃癌的實驗手段。
　　 2.2D-DIGE

13、對每個蛋白質(zhì)點(diǎn)都可以進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，保證所檢測到的蛋白精確、可靠，重復(fù)性良好。與液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)結(jié)合能對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。
　　 3.ZNF139作為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控因子，在胃癌中的表達(dá)可能通過促進(jìn)Fascin、hnRNPA2/B1和抑制ANXA1的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，進(jìn)而說明ZNF139可能直接或間接參與胃癌的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。
　　 4.A.NXA5在siRNA-ZNF139組的腹腔