人胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：利用二維差異凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional differentialgel electrophoresis，DIGE)建立分辨率高和重復(fù)性好的人胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腺癌細胞的差異蛋白表達圖譜，進一步運用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorlation／ionizat-ion time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFM

2、S)鑒定差異表達的蛋白，以尋找胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。 方法：(1)收集、篩選8例新鮮的人胃腺癌原發(fā)灶癌組織及同例有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織標本進行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。用非染色冰凍切片顯微切割的方法分別獲取人胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的腺癌細胞，裂解后提取蛋白，每例取等量蛋白12.5μg隨機選4例混合，共分成2組；(2)用DIGE染料Cy2，Cy3，Cy5對樣品分別標記，然后進行雙向電泳，獲得了人胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腺癌細胞的差異

3、蛋白表達圖譜，最后使用Typhoon掃描儀進行圖像掃描和DeCyder-Differential Analysis Software(Biological Variation Ana，lysisversion 5.O)進行分析，識別兩者之間的差異表達蛋白質(zhì)；(3)用MALDI-FOF MS對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定，得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖(peptide mass fingerprint，PMF)，然后搜索數(shù)據(jù)庫鑒定出部分蛋白質(zhì)；(4)

4、利用免疫組化SP法檢測差異蛋白HSP 70在30例胃癌組織中的表達水平(高-中分化腺癌12例、低分化腺癌18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例)。 結(jié)果：(1)采用非染色冰凍切片顯微切割方法，既可以得到較純的原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的癌細胞，又不會因為染色改變蛋白所帶電荷而引起2-DE圖像模式的改變，證明它是一種省錢、簡便的樣品制備方法之一；(2)通過對8例胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腺癌細胞樣本進行二維差異凝膠電泳，建

5、立了分辨率高、重復(fù)性好的差異表達圖譜。分析顯示Gell(人胃癌原發(fā)灶中腺癌細胞)、Gel2(人胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腺癌細胞)的蛋白質(zhì)點分別為1416(similar1062，decrease 277，increase 77)、1299(similar 1050，decrease 157，increase92)；(3)運用DeCyder-Differential Analysis Software(BiologicalVariation A

6、nalysis version 5.0、)對Gell、Gel2中的蛋白質(zhì)點進行T-Test統(tǒng)計及Average Ratio分析(P=0.05，Threshold：>1.5fold或者<-1.5fold)，獲得11個差異表達蛋白質(zhì)；(4)對這11個差異蛋白質(zhì)點進行肽質(zhì)量指紋圖分析，通過數(shù)據(jù)庫查詢鑒定出5個蛋白質(zhì)點：heat shock 70kDaprotein 8 isoform 2 variant(91 PMF，gi|62896815)

7、、chaperonin(180PMF，gil3 1542947)、chaperonin(190 PMF，gi|31542947)、leucine aminopeptidase(300 PMF，gi| 12643394)、PREDICTED：hypotheticalprotein XP 515584(522 PMF，gi|55597035)，功能分析顯示這些差異蛋白質(zhì)涉及細胞生理活動的各個方面，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)；(5)免疫組化

8、結(jié)果顯示：HSP 70表達水平隨著胃癌惡性程度的增加及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移逐漸增加，其結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果一致。 結(jié)論：①本研究證實非染色冰凍切片顯微切割方法是一種簡單可行的蛋白質(zhì)樣品純化方法；②采用DIGE技術(shù)能建立分辨率高、重復(fù)性好的人胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腺癌細胞的差異蛋白表達圖譜，并結(jié)合質(zhì)譜鑒定差異表達蛋白質(zhì)；③胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腺癌細胞的差異表達圖譜很相似，共獲得11個差異表達蛋白。通過PMF分析及數(shù)據(jù)庫查詢