同種骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導回輸治療大鼠糖尿病.pdf

1、目的： 近年來，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)的患病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢，而且發(fā)病更趨年輕化。目前主要以口服藥物和注射胰島素治療為主，這兩種治療方法均存在弊端。干細胞是一群較原始的細胞，它們既具有自我更新的能力，也具有在合適的微環(huán)境里多向分化的潛能，理論上可提供豐富的胰島細胞來源，因此干細胞定向分化為胰島素分泌細胞(Insulin-producing cells，IPCs)的研究為糖尿病的治療提供了新

2、的思路。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)可能是干細胞中有希望的候選細胞，它是一種具有很強的自我復制和可塑性的成體干細胞。許多體外研究已經(jīng)將BM-MSCs成功誘導為IPCs，將其移植到糖尿病大鼠體內(nèi)，可降低血糖。因此，本研究探索高糖條件下，尼克酰胺(Nicotinamide)聯(lián)合Exendin-4是否能將BM-MSCs體外誘導為IPCs，并觀測誘導成的IPCs回輸至鏈脲

3、佐菌素(Streptozotocin，STZ)大鼠體內(nèi)對高血糖是否有治療效果。 材料與方法 1、BM-MSCs細胞的分離提取及誘導在無菌條件下取3周齡大鼠股骨，利用直接貼壁法分離BM-MSCs，LG-DMEM(5.6mmol/L)培養(yǎng)傳代。取第3代細胞上清液測胰島素水平，用流式細胞儀檢測BM-MSCs的表面標志。用HG-DMEM(25mmol/L)誘導14天，取上清液測胰島素水平。加N(10mmol/L)誘導7天，再加E

4、(10nmol/L)誘導7天，取上清液測胰島素水平。誘導后的細胞進行DTZ染色檢驗，回輸前用BrdU標記細胞。 2、動物分組與處理將28只Wistar大鼠隨機分為正常組和造模組(正常組8只)。造模組(20只)大鼠一次性腹腔注射1％ST2(50mg/kg)建立糖尿病模型。將造模成功的16只大鼠隨機分成兩組，即糖尿病組和實驗組。將誘導后并已標記的細胞腹腔回輸至實驗組大鼠體內(nèi)(5.6-6)×105/ml，正常組及糖尿病組注射生理鹽水作

5、為對照。 3、檢測指標及方法細胞培養(yǎng)及誘導的各階段采集圖像。DTZ染色的細胞采集圖像。細胞回輸后每周測大鼠體重及血糖。給藥前和實驗終止時各取血測空腹胰島素(ELISA法)。實驗終止時取大鼠肝臟、脾臟、胰腺，免疫組織化學雙染法(SABC法)檢測其中胰島素和BrdU染色雙陽性細胞的表達。經(jīng)圖像采集分析系統(tǒng)對各組胰腺中胰島素染色陽性細胞區(qū)域占胰島區(qū)域百分比進行分析。 結(jié)果： 1、細胞分離培養(yǎng)及誘導結(jié)果細胞培養(yǎng)第13天時

6、獲得形態(tài)均一的第3代細胞，增殖能力旺盛。第3代細胞經(jīng)HG-DMEM培養(yǎng)14天后，細胞增值能力旺盛并趨向團狀、漩渦狀生長。經(jīng)N誘導7天后再加E誘導7天，細胞個體明顯增大，呈多邊形或近圓形，胞漿豐富，胞核變大，經(jīng)DTZ染色后細胞呈橙紅色。 2、流式細胞儀檢測結(jié)果BM-MSCs表達CD29、CD44陽性，陽性細胞百分率分別為95.47％，91.83％；而CD34(造血干細胞的表面特異性標志)、CD45(白細胞表面共同抗原)僅有微弱表達

7、，細胞表達的百分率分別為1.05％，1.18％。 3、生化及統(tǒng)計分析結(jié)果經(jīng)藥物誘導后的細胞上清液胰島素水平顯著高于高糖誘導后(P＜0.01)，而高糖誘導后與低糖培養(yǎng)上清液胰島素水平無統(tǒng)計學意義。造模成功后實驗組和糖尿病組大鼠血糖及胰島素無統(tǒng)計學意義。經(jīng)細胞回輸治療后實驗組大鼠血糖高于正常組(P＜0.01)低于糖尿病組(P＜0.05)。治療后實驗組大鼠胰島素水平低于正常組(P＜0.05)高于糖尿病組(P＜0.05)。 4、

8、免疫組化及圖像分析結(jié)果實驗終止時免疫組織化學檢測胰腺中胰島素陽性細胞百分比發(fā)現(xiàn)正常組明顯高于其他各組(P＜0.01)，實驗組低于正常組但是明顯高于糖尿病組(P＜0.05)，同時發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的胰島素和BrdU染色雙陽性細胞。在實驗組的肝臟中發(fā)現(xiàn)少量胰島素和BrdU雙陽性細胞表達，脾臟中亦發(fā)現(xiàn)少量雙陽性細胞表達。 結(jié)論： 1、尼克酰胺(Nicotinamide)聯(lián)合Exendin-4可以將骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為胰島素