胰島-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠Ⅰ型糖尿病的研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：體外實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 大鼠胰島的分離、培養(yǎng)及活性鑒定 目的:建立體外分離大鼠胰島細(xì)胞的方法,評(píng)價(jià)及鑒定胰島的數(shù)量及功能。 方法:1、采用膽總管穿刺灌注膠原酶P,Ficoll密度梯度離心法分離大鼠胰島。2、采用DTZ染色,AO-PI雙色熒光染色法及葡萄糖刺激試驗(yàn)鑒定胰島數(shù)量及功能。 結(jié)果: SD大鼠胰島呈不規(guī)則圓形,島狀,分離數(shù)量300-500IEQ/鼠,直徑50-200u

2、m,DTZ染色呈猩紅色,純度>95％,胰島素刺激指數(shù)>3.0。 結(jié)論:采用膽總管穿刺灌注膠原酶V型,Ficoll密度梯度離心法分離大鼠胰島簡(jiǎn)便易行,所得胰島得率及純度高,活性正常。 實(shí)驗(yàn)二 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定 目的:研究體外培養(yǎng)及擴(kuò)增大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,并行功能鑒定。 方法:用DMEM完全培養(yǎng)液徹底沖洗骨髓腔,大鼠淋巴細(xì)胞分離液離心分離,取單個(gè)核細(xì)胞層體外以完全L-DMEM培養(yǎng)液

3、貼壁培養(yǎng)至P4代,并進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo)。 結(jié)果: P4代BM-MSCS呈長(zhǎng)梭形,單核,在含10％的胎牛血清中能穩(wěn)定的貼壁生長(zhǎng),經(jīng)成骨誘導(dǎo),可出現(xiàn)鈣鹽沉積,分化為成骨細(xì)胞,經(jīng)成脂誘導(dǎo),可分化為脂肪細(xì)胞。 結(jié)論:采用密度離心及貼壁篩選法可獲得大量均一、純度高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)三 大鼠胰島-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀察體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有延長(zhǎng)胰島存活時(shí)間的作用。

4、方法:分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和胰島,分共培養(yǎng)組(30IEQ+2×104個(gè)BM-MSCs)單獨(dú)培養(yǎng)組(30IEQ),予體外培養(yǎng),檢測(cè)胰島的存活率和葡萄糖刺激的胰島素分泌量(GSIS)。 結(jié)果:隨體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),胰島與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)組的存活率與胰島單獨(dú)培養(yǎng)組的存活率差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),胰島對(duì)葡萄糖反應(yīng)性逐漸減弱,刺激指數(shù)從第1天的3.1～3.3降至第7天的1～1.6。

5、 結(jié)論:體外共培養(yǎng)條件下,BM-MSCS可延長(zhǎng)胰島的存活時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)四 建立I型糖尿病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究 目的:建立大鼠I型糖尿病模型,評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。 方法:健康SD大鼠16只禁食10h,隨機(jī)分為對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組按60mg/kg劑量向大鼠腹腔內(nèi)注入2％濃度的STZ,注藥后72h測(cè)血糖,隨機(jī)血糖連續(xù)2次超過(guò)16.7mmol/L并穩(wěn)定5d者選為糖尿病模型,對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組

6、一次建模成功SD大鼠8只,4周后隨機(jī)血糖(24.4±1.7mmol/L),體重(283.3±32.1g),24h尿量(94.6±16.1ml);對(duì)照組血糖(7.1±1.1mmol/L),體重(455.0±33.7g),24h尿量(15.1±3.8ml);P<0.05。 結(jié)論：鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠I型糖尿病建模成功率高,重復(fù)性好,可做為糖尿病動(dòng)物模型用于人類I型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)胰島-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合

7、移植治療大鼠I型糖尿病 目的; SD大鼠胰島細(xì)胞聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞門靜脈移植治療I型糖尿病大鼠,觀察其療效。 方法: 32只STZ誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠隨機(jī)分為組1(1000IEQ/只+1×106個(gè)BM-MSCs/只)、組2(500IEQ/只+1×106個(gè)BM-MSCs/只)、組3(1000IEQ/只)、組4(1×106個(gè)BM-MSCs/只),分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和胰島,門靜脈輸注移植治療四組大

8、鼠。觀察大鼠的血糖變化。 結(jié)果:1、門靜脈穿刺輸注方法一次穿刺成功率>95％,術(shù)中出血<0.5ml,手術(shù)成功率100％,圍手術(shù)期死亡率為0％。2、組1、組2、組3大鼠術(shù)后血糖可穩(wěn)定于16.7mmol/L以下的時(shí)間分別為(21.0±1.7天)、(15.2±1.3天)、(10.2±2.0天)。各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。組四大鼠血糖在術(shù)后12-14天時(shí)有-短暫向下波動(dòng),但始終未降至正常范圍內(nèi)。 結(jié)論：1、門靜脈