登革2型病毒全長(zhǎng)NS1蛋白在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達(dá)、純化及其初步鑒定.pdf

1、近年來(lái),國(guó)內(nèi)外曾用多種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NS1基因,原核表達(dá)方法簡(jiǎn)單,但其缺乏真核細(xì)胞特有的翻譯后修飾,如糖基化修飾,基因的正確剪切等,且外源蛋白難以純化.昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)可以瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白,但不適于表達(dá)大量的外源蛋白.畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)既有克隆基因篩選方便、高水平表達(dá)外源蛋白的優(yōu)點(diǎn),又有真核細(xì)胞的可對(duì)蛋白進(jìn)行多種翻譯后修飾的特點(diǎn).因此,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種良好的外源基因表達(dá)系統(tǒng).該實(shí)驗(yàn)以畢赤酵母表達(dá)DEN2全長(zhǎng)NS1蛋白

2、為目標(biāo),該課題應(yīng)用TRIzol試劑提取了DEN2(NGC株)RNA,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出全長(zhǎng)的NS1基因片段,將其克隆入載體pPICZαB中,獲得含NS1基因的重組質(zhì)粒pPICZαB-NS1;用電穿孔法將其轉(zhuǎn)化畢氏酵母X-33,生長(zhǎng)的具有Zeocin抗性的整合轉(zhuǎn)化子用MM/MD生長(zhǎng)試驗(yàn),獲得Mut+表型菌,并經(jīng)PCR確定NS1基因整合到染色體上.Mut+表型菌利用甲醇誘導(dǎo),其表達(dá)上清SDS-PAGE見一約80KD的條帶,DEN2

3、NS1特異性單抗免疫印跡證實(shí)該條帶就是DEN2特異的NS1全長(zhǎng)融合蛋白.在誘導(dǎo)劑甲醇用量、振搖速度和溫度方面進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化后,蛋白薄層掃描分析顯示,NS1全長(zhǎng)融合蛋白占酵母表達(dá)上清的20.1％.由于NS1全長(zhǎng)融合蛋白具有多聚組氨酸尾,故我們利用金屬鰲合親和層析的方法純化酵母表達(dá)上清.該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPICZ αB-NS1,在酵母表達(dá)上清中獲得了DEN2 NS1全長(zhǎng)融合蛋白,并將其純化.WB及ELISA證實(shí)純化后的蛋白具有免