HP-PRRSV感染豬后補(bǔ)體系統(tǒng)應(yīng)答研究.pdf

1、豬高致病性藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive RespiratorySyndrome,PRRS）病毒的變異株引起的一種急性高致死性傳染病，又稱豬“高熱病”。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)持續(xù)性感染會(huì)引起免疫抑制，引發(fā)細(xì)菌或病毒的繼發(fā)性感染，從而增加治療難度。因此若能從遺傳水平提高豬對(duì)PRRSV

2、的抵抗力，進(jìn)而實(shí)施抗病育種是解決PRRS危害的可行措施。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫的重要組成部分，是機(jī)體抵抗病原體的第一道防線，在抗病毒中具有重要作用。然而研究豬感染PRRSV后補(bǔ)體系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)及與機(jī)體互作鮮有報(bào)道，僅見(jiàn)肖書奇(Xiao et al.，2010)和周平(Zhou et al.，2011)分別發(fā)表的兩篇文章涉及到轉(zhuǎn)錄水平上部分補(bǔ)體基因的表達(dá)信息。前者芯片結(jié)果顯示約克夏與長(zhǎng)白雜交豬感染經(jīng)典北美PRRSV后4天和7天采肺組織樣，補(bǔ)

3、體激活因子是表達(dá)上調(diào)的，補(bǔ)體抑制因子是表達(dá)下調(diào)的，補(bǔ)體系統(tǒng)處于持續(xù)激活狀態(tài);而后者結(jié)果表明通城豬HP-PRRSV感染后5天，肺泡巨噬細(xì)胞中補(bǔ)體抑制因子CLU顯著上調(diào)，補(bǔ)體激活的關(guān)鍵因子CFP與C3的表達(dá)被下調(diào)，補(bǔ)體系統(tǒng)受到抑制。因此，為更深入研究感染PRRSV后豬補(bǔ)體系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)與功能，本研究以課題組前期已開(kāi)展的通城豬與大白豬人工感染試驗(yàn)材料和感染前后轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選到了高致病性豬藍(lán)耳病毒（Highly Pathogenic

4、 PRRS,HP-PRRSV）感染機(jī)體后補(bǔ)體系統(tǒng)差異表達(dá)基因，并對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)開(kāi)展以下研究:
　　(1)補(bǔ)體通路中的基因分析:以通城豬與大白豬HP-PRRSV感染組各3頭及對(duì)照組各3頭的肺泡巨噬細(xì)胞RNA為材料，利用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行深度測(cè)序，并用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA Sequencing,RNA-Seq）數(shù)據(jù)分析通用軟件Tophat2.0對(duì)測(cè)序產(chǎn)出reads進(jìn)行定位。然后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)錄本和基因的差異表達(dá)情況，用閾值

5、Fold Change大于等于2或小于等于2，同時(shí)P值小于等于0.01，篩選HP-PRRSV感染前后補(bǔ)體系統(tǒng)差異表達(dá)基因。測(cè)序結(jié)果顯示:通城豬中補(bǔ)體基因C3AR、C4A、C5與絲氨酸相關(guān)蛋白酶1（MBL-associated serine protease,MASP-1）基因被上調(diào)，會(huì)有利于補(bǔ)體凝集素途徑的激活;而補(bǔ)體CFP基因的下調(diào)與CFH的上調(diào)，會(huì)對(duì)補(bǔ)體旁路途徑產(chǎn)生抑制;補(bǔ)體抑制因子CD55、CD59、CLU與C4BPB的上調(diào)，會(huì)抑

6、制補(bǔ)體轉(zhuǎn)化酶和攻膜復(fù)合物的形成，從而對(duì)整個(gè)補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用。大白豬中，補(bǔ)體凝集素途徑MASP-1基因的上調(diào)、經(jīng)典途徑C1R上調(diào)以及C4A與C3AR的上調(diào)，有利于補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和凝集素途徑的激活;補(bǔ)體旁路途徑抑制子CFH的上調(diào)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化酶的CFP的下調(diào)，會(huì)對(duì)補(bǔ)體旁路途徑激活產(chǎn)生抑制作用;補(bǔ)體抑制因子C1R、CD55、CD59、CLU、C4BPB被上調(diào)，會(huì)抑制轉(zhuǎn)化酶及攻膜復(fù)合物的形成，對(duì)整個(gè)補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生抑制。綜上所述，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)看出

7、，通城豬與大白豬的補(bǔ)體系統(tǒng)都激活同時(shí)又受到抑制，但是由于通城豬中檢測(cè)到補(bǔ)體系統(tǒng)三條途徑交匯點(diǎn)C5基因的上調(diào)，而大白豬中沒(méi)有檢測(cè)到，因此推斷通城豬補(bǔ)體系統(tǒng)激活程度比大白豬高一些。
　　(2)補(bǔ)體系統(tǒng)差異表達(dá)基因的定量檢測(cè)分析:以通城豬與大白豬HP-PRRSV感染組各3頭及對(duì)照組各3頭的肺泡巨噬細(xì)胞編碼脫氧核糖核酸(Codingdeoxyribonucleic acid，cDNA)為模板，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證了通城豬與大白豬中補(bǔ)體差異

8、表達(dá)基因關(guān)鍵因子在感染HP-PRRSV后的表達(dá)情況，定量結(jié)果顯示:在通城豬與大白豬中補(bǔ)體基因C3AR、C4A、CFH、CD55、 CD59與CLU呈上調(diào)表達(dá)，而補(bǔ)體基因CFP下調(diào)表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致即補(bǔ)體系統(tǒng)激活同時(shí)又受到抑制。
　　(3) HP-PRRSV感染通城豬與大白豬7天后免疫組化檢測(cè)補(bǔ)體C3d在肺組織中的分布:結(jié)果顯示HP-PRRSV感染的通城豬與大白豬中都檢測(cè)到了補(bǔ)體C3d的大量沉積，而陰性對(duì)照組未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)

9、，并根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)體C3d是補(bǔ)體系統(tǒng)激活標(biāo)志，得出結(jié)論通城豬與大白豬補(bǔ)體系統(tǒng)被激活。
　　(4)補(bǔ)體系統(tǒng)中心因子C3在HP-PRRSV感染后血清中的變化:以HP-PRRSV感染的通城豬與大白豬各3頭為材料，以HP-PRRSV感染0天的血清為對(duì)照，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)檢測(cè)血清中補(bǔ)體C3的水平變化，結(jié)果顯示:通城豬中感染后5天與7天的C3水平顯著高于

10、感染前;在大白豬中補(bǔ)體C3水平一直處于穩(wěn)定，且感染HP-PRRSV后的C3水平與感染前差異不顯著。通城豬與大白豬相比，通城豬在感染后第5天補(bǔ)體C3水平顯著高于大白豬第5天血清中補(bǔ)體C3水平，感染后第7天補(bǔ)體C3水平極顯著高于大白豬第7天水平，這說(shuō)明HP-PRRSV感染后通城豬補(bǔ)體系統(tǒng)激活程度比大白豬高，同時(shí)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道血清中補(bǔ)體C3水平升高利于機(jī)體清除病毒，因此也推斷出通城豬與大白豬相比可能更有效的清除藍(lán)耳病毒。
　　本研究從轉(zhuǎn)錄

11、水平與蛋白水平初步探索了對(duì)HP-PRRSV感染通城豬與大白豬后補(bǔ)體系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng):從轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)來(lái)看HP-PRRSV感染通城豬與大白豬后，補(bǔ)體系統(tǒng)激活的同時(shí)又受到補(bǔ)體抑制因子的抑制。蛋白水平上免疫組化檢測(cè)到補(bǔ)體系統(tǒng)激活標(biāo)志蛋白C3d在通城豬與大白豬肺組織中大量沉積，表明補(bǔ)體系統(tǒng)都被激活;而ELISA測(cè)定血清中補(bǔ)體C3水平在品種間存在差異:感染高致病性藍(lán)耳病毒后通城豬第5天與第7天血清中補(bǔ)體C3水平都顯著高于大白豬第5天和第7天水平。蛋白水平