ADAM17介導的豬源TNFα抑制PRRSV感染的研究.pdf

1、2006年，中國爆發(fā)了大規(guī)模的由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）引發(fā)的高熱病，呈現(xiàn)高熱、高發(fā)病率和高死亡率特征，嚴重危害豬只的健康，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。有研究報道，PRRSV感染引發(fā)炎癥反應時會伴隨大量TNFα的分泌產生。然而，迄今為止，有關豬源TNFα分泌機制的研究尚未有報道。此外，隨著對TNFα生物學活性的深入研究，TNFα的抗病毒作用也引起人們越來越多的興趣和關注。
　　為探究TNFα對PRRSV

2、感染的影響，本研究針對HP-PRRSV HuN4毒株，首先采用ELISA方法檢測豬原代肺泡巨噬細胞（PAMs）在HP-PRRSV HuN4毒株感染后不同時間段TNFα的分泌情況，從而直接分析PRRSV感染對PAMs分泌TNFα的影響，結果發(fā)現(xiàn)PAMs在PRRSV感染后分泌TNFα的水平顯著提高。為進一步從細胞感染角度揭示TNFα在PRRSV感染中的作用，本研究選擇Marc-145細胞作為分析TNFα影響PRRSV感染的基礎細胞系，然后采

3、用瞬時轉染的方法構建能夠分泌 TNFα的 Marc-145細胞模型，接種病毒后，利用熒光定量 PCR、TCID50以及間接免疫熒光技術檢測病毒感染復制的情況，結果顯示 TNFα對PRRSV感染具有明顯的抑制作用。
　　去整合素-金屬蛋白酶17（ADAM17）是最先發(fā)現(xiàn)的剪切酶，可介導多種可溶性蛋白的產生，為進一步探究豬源TNFα的分泌機制，展開了對ADAM17介導豬源TNFα分泌的研究。該研究首先在豬原代肺泡巨噬細胞PAMs上采用

4、ADAM17激活劑及抑制劑對其活性進行修飾，結果發(fā)現(xiàn)在活化的ADAM17的PAMs細胞上清中TNFα分泌明顯上調，而經(jīng)ADAM17抑制劑預處理的PAMs幾乎無TNFα分泌。該結果初步揭示了ADAM17可介導PAMs中TNFα的分泌。為進一步確定ADAM17介導豬源TNFα的分泌，本實驗采用瞬轉的方法在體外構建了能夠表達豬源TNFα的細胞模型（HEK293/TNFα），然后用ADAM17抑制劑及基因過表達技術對 ADAM17活性進行修飾。

5、結果顯示，在 ADAM17活性被抑制的細胞上清中TNFα分泌量顯著降低，而在ADAM17活性持續(xù)增強的細胞上清中TNFα分泌量明顯增加。最后，本研究采用shRNA基因敲除技術構建了將ADAM17基因沉默的HEK293細胞，從而特異性分析ADAM17對豬源TNFα的剪切作用。結果顯示在ADAM17基因沉默的HEK293細胞中，幾乎無TNFα分泌。綜合以上，研究結果證明豬源TNFα的分泌是由ADAM17介導產生的。此外，本研究采用基因定點突