補體系統(tǒng)與疾病

1、補 體 系 統(tǒng) 與 疾 病及 靶 向 治 療 策 略宋宏彬 軍事醫(yī)學科學院疾病預防控制所,概 述,補體系統(tǒng)是由存在于人或脊椎動物血清與組織液中的一組可溶性蛋白及存在于血細胞與其它細胞表面的一組膜結合蛋白和補體受體所組成。在機體的免疫系統(tǒng)中擔負抗感染和免疫調節(jié)作用, 并參與免疫病理反應。補體是天然免疫（Innate immunity）的重要組成部分。,Jules Bodet (1870-1961),Discovere

2、r of Complement1894 Bordet發(fā)現(xiàn)綿羊抗霍亂血清能夠溶解霍亂弧菌，加熱56℃ 30 min 阻止其活性。Ehrlich在同時獨立發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，將其命名為 補體（Complement）,補體系統(tǒng)的組成： 補體分子 補體受體,C1~C9,B、D、P因子C1INH、C4BP、H、I、S蛋白,C1qR、C3b/C4bR (CRI)、3dR(CRII)、H

3、因子受體、C3a和C5a受體等,一、第一組分：是由9種補體成分組成，命名為C1，C2……C9。其中C1是由三個亞單位組成，命名為Clq、Clr、Cls，因此第一組分是由11種球蛋白組成。二、第二組分：在70年代又發(fā)現(xiàn)一些新的血清因子也參與補體活化，但它們不是經(jīng)過抗原抗體復合物的活化途徑，而是通過旁路活化途徑。這些因子包括B因子、D因子和P因子。三、第三組分：多種參與控制補體活化的抑制因子或滅活因子，如C1抑制物、I因子、H因子、

4、C4結合蛋白過敏毒素滅活因子等。這些因子可控制補體分子的活化，對維持補體在體內的平衡起調節(jié)作用。,補體分子的組分,一、由肝細胞、巨噬細胞以及腸粘膜上皮細胞等多種細胞產(chǎn)生均為多糖蛋白，大多數(shù)電泳遷移率屬α、γ球蛋白。二、含量約占血清球蛋白總量的10%，其中C3含量最高、D因子含量最低。三、固有成份間的分子量差異較大，其中C1q最大、D因子最 小。四、對熱不穩(wěn)定，56℃、30min即被滅活，0～10℃條件下活性只能保持3～4d。五

5、、多種理化因素如射線、機械振蕩、酒精、膽汁和某些添加劑等均可破壞補體。,補體分子的理化性質,補體系統(tǒng)的激活,補體系統(tǒng)各成分通常多以非活性狀態(tài)存在于血漿中，當其被激活物質活化之后，才表現(xiàn)出各種生物學活性。經(jīng)典途徑:由抗原抗體復合物結合C1q啟動。旁路途徑:由病原微生物等提供接觸表面，而從C3開始激活。MBL途徑:由MBL結合至細菌啟動。,經(jīng)典途徑（classical pathway）,經(jīng)典途徑按其在激活過程中的作用，分為三組：1

6、.識別單位： 包括C1q，C1r，C1S.2.活化單位： 包括C4，C2，C3.3.膜攻擊單位： 包括C5～9。,IgM CH3區(qū)，IgG CH2區(qū),T,Y,,C1由 一個C1q、兩個C1r 和兩個C1s分子的共同組成。一個C1q分子如果同時與兩個以上的Fc段結合將造成其構象的變化，繼之使C1r和C1s活化，啟動補體活化的經(jīng)典途徑。,旁路途徑(alternative pathway),旁路激活的激活物質為細菌的細胞壁成分（脂多糖、肽

7、聚糖、磷壁酸和凝聚的IgA和IgG等物質）。（一）生理情況下：C3與B因子、D因子等相互作用，可產(chǎn)生極少量的C3b和C3bBb（旁路途徑的C3轉化酶），但迅速受H因子和I因子的滅活。（二）旁路途徑的激活：當細菌的脂多糖、肽聚糖、病毒、腫瘤細胞等激活物質出現(xiàn)時，H因子、I因子不能滅活C3b、C3bBb時使旁路途徑被激活。（三）激活效應的擴大：當C3被激活后，裂解為C3b，C3b又可在B因子和D因子的參與作用下合成新的C3bBb，進一

8、步促使C3裂解，血漿中有豐富的C3、B因子、Mg2+，就可能在激活部位產(chǎn)生顯著的擴大效應，此為C3b的正反饋途徑。,兩條激活途徑的比較,兩條激活途徑的共同點：　?。?） 兩條途徑都是補體各成分的連鎖反應；　　（2） 許多成分在相繼活化后被裂解成一大一小的兩個片段；　　（3） 不同的片段或其復合物可在靶細胞表面向前移動，在激活部位就地形成復合物。,兩條激活途徑的主要不同點：,比較項目

9、經(jīng)典途徑 旁路途徑 激活物質 免疫復合物 脂多糖、酵母多糖等 參與成分 C1~C9 C3,B、D、P因子,C5~C9 所需離子 Ca2+, Mg2+

10、 Mg2+ C3轉化酶 C4b2b C3bBb C5轉化酶 C4b2b3b C3bBb3b(C3bnBb) 作 用 參與特異性體液 參與非特異性免疫 免疫效應階段 （感染早期）,,,,經(jīng)典途徑,MBL途徑,旁路途

11、徑,免疫復合物,病原體甘露糖殘基,C1、C4、C2,MASP、C4、C2,病原體表面,C3、B、D,,,,,,,,C3轉化酶,C5轉化酶,攻膜復合體,,,,,補體激活過程的調節(jié),補體系統(tǒng)的激活必需在適度調節(jié)的情況下進行，才能發(fā)揮正常的生理學作用。補體激活失控，則大量補體無益消耗，導致機體感染能力下降，而且會使機體發(fā)生劇烈炎癥反應或造成自身組織細胞的損傷。補體活化途徑的調節(jié)主要包括：（一）補體自身衰變的調節(jié)（二）可溶性補體調節(jié)因子的

12、作用（三）膜補體調節(jié)蛋白和補體受體的作用,（一）自行衰變的調節(jié)　　某些補體成分的裂解產(chǎn)物極不穩(wěn)定，易于自行衰變，成為補體激活過程中的一種自控機制。例如：C4b2b中的C2b自行衰變，使其不能持續(xù)激活C3，限制了后續(xù)補體成分的連鎖反應。,（二）可溶性補體調節(jié)因子的作用　　 （1）C1抑制物（C1 inhibitor，C1INH）: 可與C1不可逆地結合，使后者失去酯酶活性，不再裂解C4和C2，不再形成C4b2b（C3轉化酶），

13、從而阻斷或削減后續(xù)補體的反應。 （2）C4結合蛋白（C4 binding protein，C4bp）: 能競爭性地抑制C4b與C2b結合，因此能抑制C42的形成。　?。?）I因子（又稱C3b滅活因子，C3b inactivator，C3bINA）: 能裂解C3b，使其成為無活性的C3bi，因而使C4b2b及C3bBb均失去與C3b結合成C5轉化酶的機會?！　。?）H因子（factor H）:　H因子不僅能促進I因子滅活C3b

14、的速度，更能競爭性地抑制B因子與C3b的結合，還能使C3b從C3bBb中置換出來，加速其滅活?！　。?）S蛋白（S protein）:　S蛋白能干擾C5b67與細胞膜的結合?！　。?）C8結合蛋白（C8 binding protein，C8bp）（又稱同源性限制因子，homologous restriction factor，HRF）: C8bp可阻止C5678中的C8與C9的結合，從而避免危及自身細胞膜的損傷作用。,1. C1 抑

15、制分子（C1 inhibitor, C1INH),,結合活化的C1rC1s，使其失去正常酶解底物C4和C2的功能,C1IHN缺陷引起血管神經(jīng)性水腫,2. C4結合蛋白（C4 Binding Protein) 結合C4b，抑制C4b與C2的結合，防止C3轉化酶的組裝，促進I因子對C4b的蛋白水解。,3. H因子（factor H)能與C3b結合，抑制旁路途徑C3轉化酶（C3bBb）作為I因子的輔助因子（Cofactor）水解C

16、3b為iC3b和C3f,4. I因子（FactorI） 裂解C3b為iC3b和C3f, 繼而裂解iC3b為C3c和C3dg 裂解C4b為C4c和C4d,5.Ｓ蛋白的作用 結合Ｃ5b67, 阻止膜攻擊復合物的形成,補體調節(jié)的同源限制,1. 當靶細胞與補體均來自同一種屬時，補體溶細胞效應受到抑制。2. 導致同源限制的調節(jié)蛋白稱為同源限制因子（homologous restriction factors， HRF）： C

17、D46(MCP)、CD55(DAF)、CD59和CR1等。,,,DAF (Decay Accelerating Factor, CD55) 促衰變因子,CD59: C8結合蛋白，結合C8, 阻斷C9的聚合,補體受體及其功能,一. CR1（CD35）,CR1的免疫功能：　　（1） 中性粒細胞，單核，巨噬細胞上的CR1，可與結合在細菌或病毒上的C3b結合，促進吞噬細胞的吞噬作用;　?。?） CR1與C3b或C4b結合后，可促

18、使C3轉化酶（C3bBb或C4b2a）降解;　?。?） 作為I因子的輔助因子，促進I因子對C3b和C4b的裂解作用;　?。?） CR1體內90％的CR1存在于紅細胞上,帶有C3b的免疫復合物與紅細胞的CR1結合后，可隨血流到肝臟被清除;　?。?） B淋巴細胞膜上的CR1對B細胞的分化有促進作用。,CR1的清除免疫復合物效應,2. CR2(CD21)　 其配體為C3dg、 C3d和iC3b CR2主要存在于成熟B細胞和樹突

19、狀細胞，單核細胞、K細胞、胸腺細胞也表達少量CR2。,CR2的功能: 調節(jié)B細胞活化 介導EBV感染 結合免疫復合物，促進吞噬作用,三. CR3（CD11b/CD18）,CR3的配體是iC3b，但CR1、CR2也和iC3b反應。主要分布于中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞上； CR3和CR4（CD11c/CD18）參與調理吞噬作用； 白細胞粘附缺陷病（leucocyte adhesion deficiency）病人缺乏

20、β鏈。病人的中性粒細胞雖正常，但不能留在感染的部位，因此病人易反復遭受感染。,中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞高度表達本受體，與吞噬功能有關。其配體為iC3b、C3d和C3dg。,三. CR4（gp150/95，CD11c/CD18）,,補體受體的特征,補體的生物學功能,（一）溶菌和細胞溶解效應補體系統(tǒng)通過經(jīng)典途徑、旁路途徑或MBL途徑被活化后，可在靶細胞上形成膜攻擊復合物，導致靶細胞的溶解；補體的這一功能在機體的免疫系統(tǒng)中起重要的防

21、御和免疫監(jiān)視作用，可以抵抗病原微生物的感染；當某些病人出現(xiàn)先天性或后天性的補體缺陷時，出現(xiàn)的最重要表現(xiàn)是容易遭受病原微生物的侵襲而出現(xiàn)反復性感染。,,,溶菌,溶細胞,補體的溶細胞作用,（二）調理作用 調理作用又稱促吞噬作用，補體和抗體均具有調理作用。在吞噬細胞表面有多種補體受體，如CR1，CR2，CR3等，結合了靶細胞或抗原的補體片段（C3b/C4b)可與吞噬細胞表面的補體受體特異結合，促進兩者的接觸，增強吞噬作用和胞內氧

22、化作用，最終使機體的抗感染能力增強。（三）免疫粘附和清除免疫復合物 細菌或免疫復合物激活補體、結合C3b/C4b后，若與表面具有相應補體受體（CR1）的RBC和血小板結合，則可形成較大的聚合物，通過血液循環(huán)到達肝臟和脾臟，被巨噬細胞吞噬。,補體調理作用,,,,,免疫復合物,C3b受體,紅細胞,補體的免疫黏附作用,清除免疫復合物,（四）促進中和及溶解病毒作用,在病毒與相應抗體形成的復合物中加入補體，可明顯增強抗體對病毒的中和

23、作用；在沒有抗體存在時，補體也可對病毒產(chǎn)生溶解滅活作用。,（五）炎癥反應 C3a，C4a，C5a，具有過敏毒素作用，可使表面具有相應受體的肥大細胞和嗜堿性粒細胞等脫顆粒，釋放組胺等血管活性物質，引起血管擴張、通透性增強、平滑肌收縮和支器官痙攣等的作用； C3a和C5a對中性粒細胞具有趨化作用，吸引具有相應受體的中性粒細胞和單核吞噬細胞向補體激活的炎癥區(qū)域游走和聚集，增強炎癥反應； C2a具有激肽樣作用：使小血

24、管擴張、通透性增強、引起炎癥性充血和水腫作用。,,,,肥大細胞,過敏介質,,,,,,,,,,,,,,,,,C5a,C3a,補體的過敏毒素作用,,,,,,,,,C567,C5a,C3a,補體的趨化作用,中性粒細胞,單核-巨噬細胞,血管,組織,（六） 免疫調節(jié)作用 補體活化過程中產(chǎn)生的活性片段可與免疫細胞相互作用，對免疫功能起調節(jié)作用。例如，C3d，Ba，Bb等片段對B細胞的功能可產(chǎn)生調節(jié)作用；C5a可

25、促進多種細胞因子如IL-1，IL-6，IL-8，TNF?的產(chǎn)生等。,補體系統(tǒng)與疾病,1.補體缺陷 2.補體與炎癥性疾病 3.補體與病毒感染 4.補體與腫瘤,,,1. 補體缺陷,除了C2缺陷和C1INH缺陷相對較常見外，其它補體成分的缺陷均非常罕見。補體先天性缺陷患者的兩大臨床表現(xiàn)是反復感染和自身免疫病，這也從反面證實了補體在抗感染免疫和免疫調節(jié)方面的重要意義。,補體缺陷的臨床表現(xiàn),C1IHN缺陷引起血管神經(jīng)性水腫),由

26、于C1INH缺陷，C1便被無限制地激活，造成C4、C2裂解，因此C1INH缺陷中層患者常伴有C2、C4水平降低。在疾病發(fā)作時可測不到C4和C2。C1INH缺陷使血漿血管舒緩紗釋放增加，從而使緩激肽、激肽均增加，引起血管通透性增加，形成組織水腫。,2.補體與炎癥性疾病,補體在活化過程中產(chǎn)生的片段具有一些新的生物學活性，其中C5a，C3a，C4a具有過敏毒素效應，C5a具有趨化活性，這些片段在促進炎癥反應中起重要作用，因而在一些炎癥相關

27、的疾病中，補體起重要的病理作用;包括自身免疫病、心血管疾病、感染過程中的炎癥性組織損傷、超急性移植排斥等;通過抑制補體有可能受到治療疾病的效果。,補體與類風濕關節(jié)炎,圖1 補體激活促進類風濕關節(jié)炎發(fā)展沉積在關節(jié)中的自身抗體、免疫復合物（IC）、凋亡細胞、死亡細胞以及纖維調節(jié)素（FM）等分子以不同途徑激活補體系統(tǒng)，最終形成攻膜復合體（MAC）破壞正常細胞和組織；同時，補體激活過程中釋放的炎性過敏毒素C3a和C5a趨化和活化嗜中性粒細

28、胞和巨噬細胞，這些細胞釋放蛋白酶和細胞因子趨化T、B淋巴細胞和其它炎性細胞，進一步促進了炎癥反應過程。,補體與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（一）,Figure 2. DAF deficiency in MRL/lpr mice caused severedermatitis. Almost all MRL/lpr-DAFK/K mice developed severe skin inflammation and open lesion by 5

29、month old (A). None of the MRL/lpr littermate controls developed such skin disease (B).,補體在SLE病理過程中的作用有相當?shù)膹碗s性，具有雙重作用。一方面，SLE患者體內補體被強烈活化，病變部位有補體沉積，表明補體在SLE中有病理損傷作用，尤其是狼瘡腎炎，沉積于腎小球的免疫復合物通過激活補體，導致炎癥性損傷；另一方面，補體活化的經(jīng)典途徑早期蛋白成份

30、的缺陷與SLE的易感性顯著相關，并且補體與免疫球蛋白結合形成空間阻隔，阻斷免疫球蛋白Fc和Fc的相互作用，從而抑制免疫復合物（IC）的形成或使其失去穩(wěn)定性，同時通過結合ICs上的補體C3b與紅細胞上的CR1受體結合，ICs被帶到肝脾清除掉，提示補體的存在可能對抵抗SLE的發(fā)生發(fā)展具有保護作用。,補體與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（二）,補體與缺血性中風,1999年Huang等在《Science》發(fā)表論文證明：缺血性中風造成的神經(jīng)炎性損傷與補體激活和P

31、選擇素高表達導致的中性粒細胞遷移有密切關系。研究表明：腦缺血后血腫及其周圍C3d活性增強，72小時達到高峰，到7天仍處于較高水平，側基底節(jié)C9含量增加6倍，持續(xù)3天，隨后沉積于神經(jīng)細胞膜上，進一步提示腦中風后有補體系統(tǒng)的激活，并導致一系列炎性繼發(fā)性腦損傷。在誘導C1q基因缺陷的腦缺血小鼠模型中，由于缺乏經(jīng)典補體活化途徑，可以明顯減輕繼發(fā)性炎性損傷程度。,補體與缺血性中風,C3基因缺陷組和靶向補體抑制物CR2-Crry治療組與野生型對

32、照組腦梗塞體積的對比 ： C3基因缺陷組和CR2-Crry治療組腦梗塞體積明顯小于對照組(p<0.001)。B、C、D為腦組織TTC染色結果。,補體與缺血性中風,缺血性中風24小時后腦組織病理學情況對比 ： A-F為Nissl染色，G–L為HE染色，和野生型對照組相比，C3缺陷小鼠和CR2-Crry治療小鼠對神經(jīng)細胞有較好的保護功能。,補體與創(chuàng)傷性脊髓損傷（SCI),創(chuàng)傷性脊髓損傷造成神經(jīng)和血管結構的斷裂（原發(fā)性損傷）和進行性的

33、繼發(fā)病理機制變化（繼發(fā)性損傷），兩者共同決定了功能恢復的程度。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠SCI模型中補體分子C1q、C4和C5b9大量沉積在損傷部位的神經(jīng)元和少突神經(jīng)膠質細胞上，并且在損傷的恢復過程中脊髓損傷部位中補體抑制物H因子水平明顯升高，提示補體激活不僅參與了SCI的繼發(fā)炎癥損傷，而且補體抑制物通過抑制補體激活也促進了損傷的修復。,,在SCI脊髓損傷部位免疫熒光染色檢測C3分子的沉積 A：損傷后1h; B：損傷后24h; C：損傷后7

34、2h; D: 假手術對照組。結果顯示：SCI脊髓損傷部位有大量C3分子沉積，證明SCI繼發(fā)炎癥損傷與補體激活有關。,補體與創(chuàng)傷性脊髓損傷（SCI),,脊髓損傷后7d和21d損傷部位病理切片：H&E染色 結果顯示：和對照組比較，C3缺陷小鼠組和CR2-Crry治療組7d和21d壞死程度明顯減輕。,補體與創(chuàng)傷性脊髓損傷（SCI),3.補體與病毒感染,補體受體及補體膜表面調節(jié)蛋白與病毒感染的關聯(lián)受到越來越多的重視，一些病毒可通過

35、補體受體等感染宿主細胞；EB病毒通過CR2感染B細胞，麻疹病毒通過MCP感染機體細胞，柯薩其病毒、?？刹《竞湍c道病毒可通過DAF感染細胞等；在臨床上，可考慮應用補體受體的阻斷劑治療某系某些病毒感染。,4.補體與器官移植的超急性、急性和慢性排斥反應,超急性移植排斥的主要原因是補體系統(tǒng)的全身性激活，導致對機體自身的廣泛性組織損傷。,補體與排斥反應,目前在臨床前研究的解決方案是： （1）利用補體抑制劑如可溶性CR1進行藥物治療；

36、 （2）應用轉基因技術: 目前已開展了CR1、DAF、CD59、MCP等膜表面補體調節(jié)蛋白轉基因豬的實驗研究，將其器官移植至靈長類動物后，由于補體調節(jié)蛋白對補體的抑制作用，可有效阻止超急性移植排斥的發(fā)生，使移植的器官存活時間明顯延長。,4.補體與腫瘤,機體對腫瘤的免疫包括細胞免疫和體液免疫，體液免疫中通過抗體依賴介導的細胞毒作用（ADCC）和補體依賴的細胞毒作用(CDC)作為體液免疫中重要的抗腫瘤機制； 補體調節(jié)蛋白（CRP）在調節(jié)

37、補體攻擊腫瘤細胞和在腫瘤逃避免疫攻擊中起了非常重要的作用； 在胃癌、腸癌、肺癌、腎癌、子宮內膜癌、神經(jīng)纖維瘤和乳腺癌等腫瘤表面高表達一種或多種補體調節(jié)蛋白（CD46(MCP), CD55(DAF), CD59 ），從而抑制補體對腫瘤的細胞溶解作用，使腫瘤逃避免疫攻擊。,補體與腫瘤,補體調節(jié)蛋白（CRP）在腫瘤細胞上的高表達，一方面使腫瘤細胞逃避補體的攻擊，另一方面也嚴重降低了治療性單克隆抗體抗腫瘤效果（抑制了CDC作用）。利用抗H

38、ER-2/neu 抗體（Herceptin）誘導乳腺癌細胞的補體裂解作用，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞上的補體調節(jié)蛋白（CRP）被中和抑制后，補體依賴的細胞毒作用(CDC)從10%升高到80%。被FDA批準用于晚期乳腺癌治療的Herceptin（抗HER-2/neu 抗體）目前已進入II期臨床試驗治療非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC), 然而，臨床實驗結果顯示：Herceptin治療NSCLC的有效

39、率低于l5％，結果不盡人意，腫瘤細胞CD55(DAF)高表達是抗體療效不佳的原因之一。,補體與腫瘤,Meth-A 纖維瘤細胞和MM46乳腺癌細胞高表達補體調節(jié)蛋白Crry 腫瘤細胞與抗Crry/p65抗體(5D5)孵育，細胞PBS洗過后，用FITC標記的抗IgG抗體進行流式細胞檢測。,分別皮下注射腫瘤細胞以及與抗Crry/p65 IgG抗體(5D5)、抗Crry/p65 F(ab)2抗體孵育的腫瘤細胞小鼠生存率和腫瘤生長情況比較

40、 Meth-A 纖維瘤細胞和MM46乳腺癌細胞，通過Crry中和抗體5D5預處理這些細胞系后，分別接種其同系小鼠BALB/c中，結果顯示抗Crry/p65 IgG抗體組腫瘤生長明顯受到抑制，抗Crry/p65 IgG抗體處理的MM46乳腺癌細胞組小鼠生存率明顯提高，但抗Crry/p65 IgG抗體處理的Meth-A 纖維瘤細胞組小鼠生存率提高不明顯。,補體相關藥物研究進展,SLE (lupus)（系統(tǒng)性紅斑狼瘡） Rheum

41、atoid arthritis（類風濕性關節(jié)炎）Multiple Sclerosis (多發(fā)性硬化癥 )Renal disease/nephritis（腎病/腎炎）Transplant rejection（器官移植）Cardiopulmonary bypass syndrome（心肺旁路）Myocardial infarction (心肌梗死）Septic shock （敗血癥休克）Ischemia and reperfu

42、sion injury（缺血再灌注損傷)Stroke（中風）,,,,多種系統(tǒng)補體抑制藥物正在研制中,sCR1和抗C5單抗已分別進入Ⅱ、Ⅲ期臨床,,,,,存在問題 — 缺乏選擇性和特異性,目前臨床應用的大多數(shù)免疫抑制劑缺乏選擇性和特異性，會影響機體正常的免疫應答； 系統(tǒng)性補體抑制物雖然改善了局部炎癥反應，但同時全身性的補體抑制，也會造成感染等副作用。,,新的思路 — CR2靶向補體抑制物,能抑制局部炎癥中的補體激活 —— 靶向

43、聚集于炎癥部位，提高療效 不影響補體在機體中免疫作用 —— 降低毒副作用,,結合于補體激活位點,補體抑制物,CR2 配體,,,針對補體激活位點的補體受體2（CR2）靶向補體抑制物,,,,,,,,,,,,,補體激活,,,炎癥反應,CR2,補體抑制物,細胞表面沉積的C3dg、iC3b、C3d 分子,CR2靶向補體抑制物的構建、表達、篩選與鑒定 CR2靶向補體抑制物親和力的測定 CR2靶向補體抑制物生物學活性的鑒定 CR2靶

44、向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治 療作用 CR2靶向補體抑制物在膠原誘導的類風濕關節(jié)炎小鼠中的治療作用,,前期實驗研究,,CR2靶向補體抑制物的構建、表達、純化與鑒定,,圖1 CR2靶向補體抑制物的構建圖示（部分）構建通過CR2 N端連接補體抑制物的蛋白和通過CR2 C端連接補體抑制物的蛋白以及非靶向補體抑制物,CR2靶向補體抑制物CHO高效表達株的篩選與鑒定,圖2 兩種不同方法篩選的CR2DAFGS-CHO細胞

45、系在不同條件無血清培養(yǎng)基中蛋白的產(chǎn)量,CR2靶向補體抑制物體外靶向性的鑒定 -----CR2 N端連接補體抑制物的靶向蛋白與其配體C3dg親和力較高,圖3 通過SPR技術分析CR2靶向補體抑制物和C3dg分子的相互作用親和力的測定,CR2靶向補體抑制物體內靶向性的鑒定 —— 在炎癥免疫損害部位高度聚集,,圖4 24周齡MRL/lpr腎炎小鼠腎組

46、織切片免疫熒光 a:尾靜脈注射靶向補體抑制物CR2DAF 24小時；b: 尾靜脈注射可溶性補體抑制物DAF 24小時。證明：和非靶向補體抑制物相比，靶向補體抑制物可在免疫損害部位高度聚集。,CR2靶向補體抑制物生物學活性的鑒定 ----- 抑制補體介導的細胞裂解的效能提高了20倍,,,圖5 CR2靶向補體抑制物對補體介導的細胞裂解的抑制,,,CR2靶向補體抑制物在小鼠腸道缺血再灌注(IRI)急性炎癥損傷模型

47、中的作用 —— 劑量效應關系,圖6 A：不同治療劑量下的腸道粘膜損傷計分 B：不同治療劑量下的腸道絨毛高度,CR2靶向補體抑制物在小鼠CLP感染模型中的作用 —— 副作用的評價,圖7 CR2靶向補體抑制物和非靶向補體抑制物在小鼠CLP感染模型中存活率的比較 采用盲腸結扎穿孔(ceca

48、l ligation and puncture，CLP)法制作腹腔感染膿毒癥C57BL/6小鼠模型，分別注射單劑量PBS (n = 18), CrryIg (1.0 mg; n = 8)和CR2Crry(0.1 mg; n = 10)以及多劑量 CR2Crry (0.1 mg; n = 10)，結果顯示：CrryIg組在48小時內全部死亡，CR2Crry組（不論是單次注射還是多次注射組）存活率明顯提高，和PBS組相比未有明顯差別；并且C

49、R2Crry劑量低于CrryIg 10倍，靶向補體抑制物比非靶向系統(tǒng)補體抑制物造成感染的副作用明顯降低。,CR2靶向補體抑制物在BALB/C小鼠中生物半衰期 ----- 生物半衰期（t1/2）約為9h,,圖6 CR2Crry平均血清循環(huán)水平 BALB/C小鼠i.v注射CR2Crry 0.1mg，ELISA測定血清CR2Crry濃度，結果顯示CR2Crry的生物半衰期（t1/2）為9h。 CR2靶向補

50、體抑制物在系統(tǒng)免疫抑制的風險性遠遠低于非靶向補體抑制物,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作用 ----- 靶向腎臟炎癥損害部位,,圖 7 16周MRL/lpr小鼠CR2Crry在體內生物學分布 小鼠尾靜脈注射125I-CR2Crry后，24h(A)、48h(B)和72h(C)體內主要器官的125I-CR2Crry的

51、分布，顯示CR2Crry在腎臟高度聚集。,,,,24h,48h,72h,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作用 -----靶向并持續(xù)作用于腎臟炎癥損傷部位,,圖 8 CR2Crry在MRL/lpr小鼠腎臟中定位（共聚焦顯微鏡免疫熒光染色）16周MRL/lpr小鼠尾靜脈注射0.25mg CR2Crry后，24h(A，B)、48h(C,D)和7d(E,F)分離腎臟制備切片，A、C

52、、E為雙色熒光疊加圖；B、D、F為DCI熒光疊加圖，綠色熒光為抗CR2抗體顯示CR2Crry定位，顯示在24h、48h和7d腎小球中CR2Crry均存在。,,,,24h,48h,7d,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作用 ----- 改善了腎功能,,圖9 MRL/lpr小鼠CR2Crry治療組和PBS對照組蛋白尿情況對比 在第22周和24周時，與對照組相比，治療組

53、的蛋白尿水平明顯降低（P<0.01）。,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作用 ----- 減輕了腎臟的炎癥反應,,表 1 MRL/lpr小鼠從16周到23周治療后第24周CR2Crry治療組和PBS對照組腎臟損害情況對比 和對照組相比，治療組的腎小球積分、血管炎和新月體/壞死等明顯降低（P0.05）。,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作

54、用 ----- 降低了皮膚損害,,,圖10 MRL/lpr小鼠從16周到24周CR2Crry治療組和PBS對照組皮膚可見損害發(fā)生率（A）和皮膚損害累計病理總積分（B）情況對比 和對照組相比，從18周起治療組的皮膚損害明顯降低。,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作用

55、 ----- 減輕了肺組織炎癥,,圖11 MRL/lpr小鼠從16周到23周治療后第24周CR2Crry治療組（B,n=7）和PBS對照組(A，n=10)肺組織H&E染色對比 CR2Crry治療組（B,n=7）和PBS對照組相比，炎癥反應明顯減輕。,MRL/lpr小鼠從16周到23周治療后第24周CR2Crry治療組和PBS對照組腎小球中免疫球蛋白和補體分子沉積（免疫熒光染色）情況對比 和對照組相比，治療組的腎小球

56、免疫球蛋白和補體分子沉積明顯降低。,CR2靶向補體抑制物在MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠中的治療作用 ----- 提高了生存率,,圖12 MRL/lpr小鼠從16周到24周不同劑量CR2Crry治療組（n=16)和PBS對照組(n=20)小鼠生存率的對比 和對照組相比，從19周起治療組的小鼠生存率明顯提高。,CR2靶向補體抑制物在膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠中的

57、治療作用 ----- 明顯改善臨床癥狀,,,圖13 膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠相同劑量不同治療次數(shù)組臨床癥狀評分 從第25天至35天，CR2Crry三個治療組（0.25mg/次/只）的關節(jié)炎嚴重程度明顯低于PBS組（P<0.01）；右邊小鼠為CR2Crry治療組，左邊為PBS組。,,,,CR2靶向補體抑制物在膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠中的治療作

58、用 ——— 劑量效應關系,圖9 膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠不同劑量治療組臨床癥狀評分 0.1mg治療組和PBS組以及0.5mg和0.25mg治療組之間不存在顯著統(tǒng)計學差異（P>0.05）,但0.25mg治療組和PBS組之間存在顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01）?？赡?.25mg/只劑量適合。,CR2靶向補體抑制物在膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠中

59、的治療作用 ----- 降低了小鼠膝關節(jié)炎性因子水平,,圖14 小鼠膝關節(jié)細胞因子水平的測定：通過定量PCR檢測小鼠膝關節(jié)細胞因子mRNA水平，發(fā)現(xiàn)TNFα 和 IL-1β水平在CR2Crry治療組（7次和1次）明顯低于PBS組（P<0.01）。IL-1Ra 和 IL-10 mRNA水平在CR2Crry治療組（7次）明顯高于PBS組（P<0.01）。,CR2靶向補

60、體抑制物在膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠中的治療作用 ----- 降低了關節(jié)組織的炎性反應,圖15 關節(jié)組織病理檢查 各組小鼠于第21天給藥，第35天取關節(jié)，脫水脫鈣后行石蠟包埋切片，HE 染色。和PBS組（c,d）比較，CR2Crry治療組（7次）小鼠關節(jié)部位炎性細胞浸潤均不明顯，滑膜增生輕微，無明顯軟骨破壞及骨浸潤等。,a,b,c,d,近年補體研究進展

61、 ----- 年齡相關性黃斑變性（AMD）,2005年4月《科學》三項獨立的研究發(fā)現(xiàn)了同一個基因 ：補體因子H (complement factor H)基因上兩個遺傳標記（SNP)與白種人老年黃斑變性有很強遺傳相關性；變異使其攜帶者患AMD的風險增加了3到7倍。 2007年8月《新英格蘭醫(yī)學雜志》 ：一個C3變異體與AMD顯著相關 。研究者指出：“這些發(fā)現(xiàn)增強了我們對年齡相關性黃

62、斑退行性變遺傳學的認識，并且為補體途徑在這種常見和嚴重疾病發(fā)病機理中起重要作用提供了結論性證據(jù)。”,,,患AMD后視力受損,正常視力,2007年9月美國和瑞典的兩個研究小組在《新英格蘭醫(yī)學雜志》上發(fā)表論文，其分別獨立鑒定出兩個類風濕性關節(jié)炎相關基因TRAF1和補體分子C5基因，這兩個基因負責控制人體內與類風濕性關節(jié)炎相關的慢性炎癥過程。,近年補體研究進展 ----- 類風濕關節(jié)炎（RA）,2006年1

63、1月《Nature》雜志發(fā)表三篇集中在C3b結構的研究文章，都主要是透過對C3b結構的分析獲得對補體系統(tǒng)的了解。來自荷蘭烏特列支大學(Utrecht University)和美國賓州大學，Genetech公司，以及美國阿拉巴馬州大學的三支研究隊伍都從C3b結構入手發(fā)現(xiàn)了補體系統(tǒng)的不正確激發(fā)，與包括關節(jié)炎、哮喘、紅斑狼瘡、自免疫心臟病和多發(fā)性硬化等疾病有關，這也是朝著設計操控補體系統(tǒng)的治療方法邁出了一步。,近年補體研究進展

64、 ----- C3b分子結構解析,新的補體受體 ---- CRIg,新的激活分子-----SIGN-R1,新的逃逸機制,第21屆國際補體大會于2006年10月23日在北京飯店召開，也是我國首次舉辦這一會議，由國際補體學會和衛(wèi)生部人才交流中心共同主辦，來自22個國家的近300名代表參加了本屆會議。此次舉行的第21屆國際補體大會是國際補體研究領域規(guī)模最大、水平最高的學術會議。補體是免疫反應的重要角色：補體不僅能直接引

65、起免疫反應，而且還是獲得性免疫被激活的重要中間物質，在試驗中，當補體或其他天然免疫系統(tǒng)缺失后，即便是接觸相同的感染源，一些原本能夠發(fā)生的獲得性免疫也沒有了。因此，補體在人體免疫反應中所起的作用，要比人們原來想象的重要得多。補體抑制劑將進臨床：過去幾年的一項重要研究就是尋找補體抑制劑，用它做成的新藥將有望通過抑制補體減輕缺血再灌注的損害。激活補體可能治腫瘤：引導補體攻擊腫瘤細胞，通過自然免疫抑制腫瘤生長。,第22屆 國際補體大會于20

66、08年9月28日在瑞士巴塞爾舉行：rC3-1 用于治療罕見的慢性血液病陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥 (PNH)；針對 C3 損耗的療法潛力已經(jīng)在黃斑變性、哮喘、風濕性關節(jié)炎以及自體免疫和炎性疾病中得到了驗證。此外，C3 損耗還被證明是手術、移植以及癌癥治療的一種有效輔助療法。,第23屆 國際補體大會于2010年8月1日在美國紐約舉行：TT30 in PNH, TT32 in Heart Transplant, TT33 in Live