GSTM2-STAT1對(duì)子宮識(shí)別附植前胚胎作用的研究.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)是一種重要的解毒酶，參與到多種生物過(guò)程中，其中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶mu亞基(GSTM)對(duì)豬的繁殖性能有重要影響。GSTM2基因第5外顯子中一個(gè)堿基的無(wú)義突變，使該基因發(fā)生了無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解，并發(fā)現(xiàn)該突變可能導(dǎo)致妊娠母豬早期流產(chǎn)或仔豬出生后夭折的現(xiàn)象。為了研究其中的作用機(jī)制，本課題組前期在豬的睪丸(ST)細(xì)胞中進(jìn)行了GSTM2基因的RNAi試驗(yàn)，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行GO、Pathways和

2、Networks分析發(fā)現(xiàn)干涉GSTM2后，部分免疫相關(guān)基因及一些粘附分子的表達(dá)發(fā)生了顯著的改變。據(jù)此推測(cè)，該基因可能對(duì)胚胎附植中炎癥反應(yīng)過(guò)程有重要的影響，其中差異基因STAT1可能與GSTM2有相互作用關(guān)系。為了進(jìn)一步研究GSTM2與STAT1間的作用關(guān)系，本研究對(duì)GSTM2基因進(jìn)行超表達(dá)，檢測(cè)了胚胎附植相關(guān)基因的表達(dá)情況。利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證二者間的關(guān)系，同時(shí)對(duì)STAT1基因進(jìn)行了超表達(dá)和干涉試驗(yàn)，并驗(yàn)證STAT1對(duì)其下游靶基因的作

3、用，以期為胚胎附植相關(guān)研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)基因進(jìn)行定量驗(yàn)證。對(duì)差異基因中12個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，qPCR結(jié)果顯示與測(cè)序結(jié)果一致。
　　2.采集不同妊娠時(shí)期和空懷的子宮內(nèi)膜樣品（時(shí)期分別為妊娠12d、15d、18d及32d），提取RNA。檢測(cè)了GSTM2、STAT1、OPN、MUC4、ITGAV、ADAMTS1等基因在不同時(shí)期子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:GSTM2

4、在妊娠18d及32d高表達(dá)，STAT1在妊娠15d和18d高表達(dá)。
　　3.構(gòu)建GSTM2超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染豬睪丸細(xì)胞，分別在24h、48h對(duì)其mRNA水平及蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示GSTM2超表達(dá)效果顯著(P＜0.01)。超表達(dá)GSTM2對(duì)STAT1蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)影響不明顯，但抑制了STAT1的磷酸化。
　　4.利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證GSTM2與STAT1的相互作用，western blot結(jié)果顯示二者相互結(jié)

5、合。
　　5.設(shè)計(jì)并合成了三對(duì)STAT1基因的siRNA片段，分別將siRNA片段轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h在mRNA水平檢測(cè)STAT1的表達(dá)情況(P＜0.05)。發(fā)現(xiàn)三對(duì)siRNA均有效果(P＜0.05)，而第二對(duì)siRNA片段干涉效果最顯著，western blot結(jié)果顯示STAT1的蛋白水平下降。
　　6.在mRNA水平分別檢測(cè)了干涉STA T1后相關(guān)基因的表達(dá)情況。其中GSTM2表達(dá)沒(méi)有改變，而OPN、ITGAV、A

6、DAMTS1及MUC4基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　7.構(gòu)建了STAT1超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞。分別對(duì)其在mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)，超表達(dá)效果顯著(P＜0.05)。并對(duì)下游基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示:GSTM2基因及黏附相關(guān)基因OPN、ITGAV、ADAMTS1及MUC4表達(dá)差異不顯著，而免疫相關(guān)基因IFIT1、IFIT3、MX1、OAS1及OAS2表達(dá)呈現(xiàn)顯著性的上調(diào)表達(dá)(P＜0.05)。
　　綜