miR-141對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7遷移和對(duì)HCV復(fù)制能力影響的機(jī)制研究.pdf

1、目的:microRNA(miRNA)是一類非編碼的單鏈小RNA分子,長(zhǎng)度為18-22個(gè)核苷酸,具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的功能。研究表明,miRNA幾乎在所有細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程包括代謝、生存、分化和凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。特定miRNA的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致多種疾病,尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們及其他研究表明,在肝癌組織中miR-141表達(dá)明顯下調(diào),但其具體作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道,我們研究目的之一擬對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7遷移能力是否受miR-141的調(diào)控進(jìn)行初

2、步探討,以期提供肝癌轉(zhuǎn)移的新標(biāo)向,具有重要的研究意義。
　　HCV的慢性感染容易導(dǎo)致肝硬化和肝癌,在中國(guó),HCV感染率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)研究報(bào)道,不同的miRNA能促進(jìn)或抑制病毒的復(fù)制,但miR-141對(duì)HCV復(fù)制的影響目前尚不清楚,我們的研究目的之二擬探討miR-141對(duì)HCV復(fù)制的影響及其機(jī)制,以期探索臨床上治療HCV感染的新靶點(diǎn),具有重要的臨床價(jià)值。
　　方法:
　　1.利用慢病毒載體感染Huh7,建立穩(wěn)定高表達(dá)

3、miR-141的Huh7-miR-141-LV及其陰性對(duì)照組Huh7-NC-LV;
　　2.TranswellAssay檢測(cè)miR-141在Huh7內(nèi)高表達(dá)和被抑制后,對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響;
　　3.qRT-PCR檢測(cè)miR-141在Huh7內(nèi)高表達(dá)后對(duì)JFH1復(fù)制的影響;
　　4.qRT-PCR及WesternBlot分別檢測(cè)細(xì)胞TGF-β、TLR/IRF信號(hào)通路中相關(guān)分子及MMP2/MMP9在mRNA水平及蛋白質(zhì)水

4、平的表達(dá)量;
　　5.雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)IFN-βLuc的活性。
　　結(jié)果:
　　1.利用慢病毒載體感染成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)miR-141的Huh7-miR-141-LV。
　　2.miR-141在Huh7中高表達(dá)后能顯著抑制Huh7遷移,而被抑制后,Huh7的遷移能力上升,因此miR-141是影響Huh7遷移能力的一個(gè)重要的因素。
　　3.在Huh7中高表達(dá)miR-141后,可通過(guò)降低其靶基因TGF-

5、βR1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量,阻斷TGF-β信號(hào)通路,進(jìn)而抑制Huh7的遷移能力;在Huh7中高表達(dá)miR-141后,還可降低MMP2和MMP9的表達(dá)量。
　　4.miR-141在Huh7中高表達(dá)后能顯著抑制HCV毒株JFH1的復(fù)制能力,并成時(shí)間依賴性。
　　5.在JFH1感染Huh7-miR-141-LV后,可促進(jìn)TLR/IRF信號(hào)途徑中的TLR7、TLR9、IRF7的mRNA水平和IRF3的蛋白質(zhì)水平。

6、>　　6.在JFH1感染前后,Huh7-miR-141-LV中IFN-βLuciferase的活性都比Huh7-NC-LV中強(qiáng),因此miR-141可能通過(guò)促進(jìn)TLR7、TLR9和IRF3、IRF7的表達(dá),激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子,從而抑制JFH1在Huh7中的復(fù)制能力。
　　結(jié)論:
　　1.miR-141在Huh7中高表達(dá)后,通過(guò)TGF-βR1阻斷TGF-β信號(hào)通路影響Huh7的遷移能力。MMP2和MMP9能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移,

7、而miR-141在Huh7中高表達(dá)后,可明顯降低MMP2和MMP9的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量,但miR-141對(duì)MMP2和MMP9的具體作用機(jī)制尚不清楚,還需進(jìn)一步深入研究。
　　2.在病毒感染細(xì)胞后,激活TLR/IRF信號(hào)通路,進(jìn)而誘導(dǎo)I型干擾素IFNα/β的表達(dá),引起細(xì)胞的抗病毒免疫應(yīng)答。miR-141可能通過(guò)促進(jìn)TLR7、TLR9和IRF3、IRF7的表達(dá),激活I(lǐng)FN-β的啟動(dòng)子,進(jìn)而抑制JFH1在Huh7中的復(fù)制能