慢加急性肝衰竭患者外周血腫瘤壞死因子-α基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、目的：
　　 通過檢測慢加急性肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α的甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，探討腫瘤壞死因子－α及表觀遺傳調(diào)控在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的可能作用。
　　 方法
　　 1、研究對象
　　 慢加急性肝衰竭患者組20例，慢性乙型病毒性肝炎患者組12例，為2009年3月-2009年12月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科住院和門診患者，均符合2000年（西安）第十次全國傳染病寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議

2、修訂的“病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)”。健康對照組12例。
　　 2、研究方法
　　 ELISA法檢測外周血腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)，并與患者的肝功能進(jìn)行相關(guān)性分析，主要檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清總膽紅素(TBIL)水平、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)、血清乙型肝炎病毒定量、終末期肝臟病模型(MELD)評分。觀察慢加急性肝衰竭患者不同病情程度血清TNF-α表達(dá)的變化，初步探討TNF-α在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用。

3、r>　　 提取外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA，重亞硫酸鹽處理后，用針對改變后的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)保持不變。根據(jù)修飾后DNA序列的不同，運(yùn)用在線MethPrimer軟件設(shè)計(jì)引物，甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specificpolymerase chain reaction，MSP)檢測標(biāo)本中TNF-α擴(kuò)增產(chǎn)物，

4、如果用引物M能擴(kuò)增出片段，則說明檢測位點(diǎn)存在甲基化；若用引物U擴(kuò)增出片段，則說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。分析TNF-α啟動(dòng)子甲基化與血清TNF-α表達(dá)的相關(guān)性，并分析甲基化與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探討DNA甲基化在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，方差分析行多組間比較，率差異行卡方檢驗(yàn)，Sp

5、earman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行兩因素相關(guān)性檢驗(yàn)，均以P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 1.外周血清TNF-α表達(dá)：慢加急性肝衰竭患者組外周血TNF-α蛋白水平均高于慢性乙型病毒性肝炎患者組和健康對照組，且各組間比較均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與血清ALT關(guān)系：統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與血清ALT無明顯相關(guān)性(r=0.185，P=0.

6、435)。
　　 3.慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與血清TBIL關(guān)系：統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與血清TBIL呈明顯的正相關(guān)(r=0.891，P<0.01)，TBIL較高的患者外周血清TNF-α水平明顯高于TBIL較低的患者。
　　 4.慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與PTA關(guān)系：統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與PTA里明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.511，P=0.021)，PTA越低的患

7、者外周血清TNF-α水平明顯高于PTA高的患者。
　　 5、慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與血清HBV-DNA的關(guān)系：統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與血清HBV-DNA之間無顯著的相關(guān)性(r=-0.026，P=0.912)。
　　 6、慢加急性肝衰竭患者組外周血清TNF-α水平與終末期肝臟病模型(MELD)評分之間的關(guān)系：統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示外周血清TNF-α水平與終末期肝臟病模型(MELD)評分之間呈明顯的正相

8、關(guān)(r=0.792，P<0.01)
　　 7、慢加急性肝衰竭患者組TNF-α啟動(dòng)子完全甲基化率為15％(3/20)，未甲基化率為85％(17/20)。慢性乙型病毒性肝炎患者組完全甲基化率為50％(6/12)，未甲基化率為50％(6/12)。健康對照組完全甲基化率為66.7％(8/12)，未甲基化率為33.3％(4/12)。慢加急性肝衰竭組、慢性乙型病毒性肝炎患者組、健康對照組TNF-α啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(x2=

9、9.343，df＝2，P=0.009)。
　　 8、慢加急性肝衰竭患者甲基化組與非甲基化組血清TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，慢加急性肝衰竭患者甲基化組血清TNF-α水平明顯低于非甲基化組(P<0.05)。慢性乙型病毒性肝炎患者甲基化組與非甲基化組血清TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，慢性乙型病毒性肝炎患者甲基化組血清TNF-α水平明顯低于非甲基化組(P<0.05)。健康對照甲基化組與非甲基化組血清TNF-α水平比較，

10、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，健康對照甲基化組血清TNF-α水平明顯低于非甲基化組(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.在慢加急性肝衰竭患者中，血清ALT水平高低已不能反映病情嚴(yán)重程度，而血清TBIL及PTA才是反映肝臟功能的常用指標(biāo)，前者水平越高，后者水平越低，反映肝臟功能越差。在慢加急性肝衰竭中，通過TNF-α與TBiL和PTA之間關(guān)系的比較，發(fā)現(xiàn)Tbil較高的患者其TNF-α水平也高，提示TNF-α可能與肝炎活動(dòng)與肝細(xì)胞損

11、害有密切關(guān)系。血清TNF-α水平與血清HBV-DNA對數(shù)值之間無顯著相關(guān)性，表明HBV本身不能直接影響血清TNF-α水平。MELD評分是反映肝功能損傷程度的良好指標(biāo)，血清TNF-α水平與MELD評分呈明顯的正相關(guān),提示血清TNF-α水平升高能夠間接反映肝功能的惡化。TNF-α可以通過多種信號(hào)通路導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死[3]，因而它在慢加急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)理當(dāng)中具有重要的作用。
　　 2.慢加急性肝衰竭患者TNF-α啟動(dòng)子甲基化程