SOD2及其單核苷酸多態(tài)性對耳蝸毛細胞氧化損傷影響的研究.pdf

1、近年來噪聲性聽力損失(Noise Induced Hearing loss，NIHL)在世界各國發(fā)病率居高不下，我國每年新增的職業(yè)病病例中有1/6來自于職業(yè)性NIHL。目前關于NIHL的發(fā)生機制國內(nèi)外學者已經(jīng)形成共識，噪聲引起耳蝸聲音轉換、血管紋保持離子平衡及外毛細胞(Outer Hair Cells，OHI)對基底膜調節(jié)等耗能活動增多，同時產(chǎn)生大量的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)誘發(fā)的耳蝸氧化應

2、激損傷是NIHL的基本病理過程。 線粒體作為產(chǎn)生能量的細胞器消耗體內(nèi)90％的氧并產(chǎn)生大量的氧自由基，如果這些活性氧不能被及時清除就有可能引起線粒體和其他細胞器的損傷。錳超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase，SOD2)主要分布于線粒體基質內(nèi)，是線粒體內(nèi)唯一能將超氧陰離子(O2-·)催化為過氧化氫(H2O2)的酶，后者則在過氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutat

3、hione Peroxidase，GPx)的作用下降解為水。作為清除自由基的關鍵酶，人們對，SOD2在氧化損傷中的作用目前尚無統(tǒng)一認識。多數(shù)學者認為高水平的SOD2可以促進超氧陰離子的降解，從而保護組織細胞免受自由基攻擊。但部分學者根據(jù)不少氧化應激相關疾病患者組織或血漿SOD2活力上升的事實，認為高水平的SOD2催化超氧陰離子生成大量的H2O2，當H2O2水平超過下游CAT、GPx的降解能力時，就會促進細胞器和組織氧化損傷的發(fā)展。

4、 編碼SOD2信號肽(線粒體靶向序列，MTS)的基因序列存在單核苷酸多態(tài)性。其編碼序列第16位密碼子有GCT(丙氨酸，Ala)和GTT(頡氨酸，Val)的互換，即C47T變異(dbSNP數(shù)據(jù)庫收錄號：rs4880)。該SNP導致位于SOD2 MTS第16位氨基酸殘基丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)替代。有關研究顯示該氨基酸殘基在SOD2靶向定位于線粒體過程中起著關鍵的作用，Ala16→Val16的替換使MTS構像從α—螺旋轉變?yōu)棣隆?/p>

5、片層，信號肽以丙氨酸作為16位氨基酸時，SOD2線粒體靶向效率明顯高于以纈氨酸作為16位氨基酸者，人群研究結果顯示該基因位點多態(tài)性與很多疾病均有關系但結論不一致。我們前期研究了SOD2單核苷酸多態(tài)性與中國接噪工人NIHL易感性的關系，結果發(fā)現(xiàn)C47T變異與NIHL易感性有關，該位點攜帶的C等位基因(Ala16，較高的SOD2線粒體靶向效率)是NIHL的危險因素，但這一研究結果與國外此前的報道并不一致。 鑒于SOD2及其基因多態(tài)性

6、與NIHL易感性關系的研究現(xiàn)況以及傳統(tǒng)的人群和動物實驗方法的不足，本研究擬從NIHL的氧化損傷機制入手，構建SOD2C47T變異高表達細胞株，利用有機氧化劑叔丁基過氧化氫(tert—Butyl Hydroperoxide，t—BHP)染毒耳蝸毛細胞HEI—OC1(House Ear Institue—Organ of Corti 1)建立毛細胞氧化損傷模型，在細胞水平上驗證SOD2單核苷酸多態(tài)性與耳蝸毛細胞氧化損傷的關系，為SOD2及其

7、SNP與NIHL的關系提供更直接的科學線索。 研究目的: (1)建立HEI—OC1細胞氧化損傷模型。 (2)構建高表達SOD2C47T變異A型和V型等位基因的小鼠耳蝸毛細胞模型。 (3)評價SOD2及其C47T變異在耳蝸毛細胞氧化損傷中的作用，為NIHL遺傳易感性的研究提供線索。 (4)為評價其他抗氧化酶基因與耳蝸毛細胞氧化損傷和NIHL易感性的關系建立體外研究方法。 研究方法:

8、(1)建立耳蝸毛細胞氧化損傷模型：光鏡觀察掌握HEI—OC1細胞一般形態(tài)學特點，細胞計數(shù)繪制生長曲線；采用t—BHP染毒，設置從30μM到4000μM8個染毒濃度組對HEI—OC1細胞染毒12h，采用臺盼藍染色法檢測細胞存活率，并繪制細胞染毒濃度—存活率曲線和100μM濃度組染毒時間—存活率曲線；MTT實驗檢測細胞增殖能力的改變；DCFH—DA探針法檢測胞內(nèi)ROS水平。通過上述方法篩選出既能在胞內(nèi)引起較高水平的ROS又對細胞存活、增殖、

9、形態(tài)改變等方面影響較小的染毒濃度和染毒時間。 (2)構建SOD2基因多態(tài)性耳蝸毛細胞：野生型SOD2(第47位堿基為T)全長ORF(OpenReadingFrame，ORF)哺乳動物表達克隆為廣州復能基因公司現(xiàn)貨，將SOD2野生型ORF序列通過定點突變后接入該真核表達載體，即可得突變型SOD2(第47位堿基為C)全長ORF哺乳動物表達克隆，該載體已引入Flag標簽，可以表達C端Flag標簽融合蛋白。通過脂質體轉染法將上述兩種表達

10、克隆和空對照克隆導入HEI—OC1細胞，采用RT—PCR檢測其轉錄水平，QuantityOne圖像分析軟件做半定量分析，采用間接免疫熒光法(IndirectImmunoFluorescenceAnalysis，IIFA)檢測其融合蛋白表達并計算轉染效率。 (3)SOD2基因變異對HEI—OC1細胞氧化損傷的影響：MTT法檢測SOD2轉染對HEI—OC1細胞增殖能力的影響；黃嘌呤氧化法檢測轉染組與對照組胞內(nèi)SOD2活性差異；染毒后

11、，DCFH—DA探針法檢測各組ROS水平差異；膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)與碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)雙標記后通過流式細胞儀檢測不同轉染組細胞早期凋亡和壞死＼晚期凋亡差別。 研究結果: (1)不同濃度的t—BHP對耳蝸毛細胞染毒12h后，100μM以上濃度組細胞存活率開始出現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的下降，其中200μM—2000μM濃度組細胞存活率呈直線下降。100μM染毒時間—存活率曲線較為平緩。MTT實

12、驗提示30μM的t—BHP染毒可以促進耳蝸毛細胞增殖，200μM以上各濃度組則抑制細胞增殖。DCFH—DA探針法檢測胞內(nèi)ROS水平顯示：無染毒細胞鏡下無熒光(—)、陽性對照為強熒光(+)、30μM和50μM濃度組則有弱熒光(—+)、100μM染毒組為強明亮熒光(++)、200μM-1000μM各組也有熒光，但隨著存活率的迅速降低視野下細胞稀疏。這提示100μMt—BHP對HEI—OC1細胞染毒12h可以很好的建立耳蝸毛細胞的氧化損傷模型

13、。 (2)DNA測序結果顯示野生型(Val16)和突變型(Ala16)SOD2哺乳動物表達克隆已被成功構建。脂質體法轉染HEI—OC1后，RT—PCR顯示野生型和突變型SOD2克隆已經(jīng)在轉染細胞胞內(nèi)轉錄，其表達水平均遠遠高于試劑盒陽性對照(2×105copies/μl)，其與內(nèi)參相對灰度值分別為：1.20±0.27和1.16±0.26，差異無統(tǒng)計學意義。IIFA顯示野生型和突變型SOD2克隆已經(jīng)成功表達Flag標簽融合蛋白，經(jīng)計

14、算，其轉染效率分別為60.2±6.4％，64.2±7.0％，差異無統(tǒng)計學意義。 (3)MTT法顯示SOD2表達質粒和空質粒轉染不影響HEI—OC1細胞的增殖能力；轉染后，各組HEI—OC1胞內(nèi)SOD2酶活力分別為(U/ml)：未轉染對照組，10.5±2.6；空質粒對照組，11.7±1.3；Ala16SOD2轉染組，36.9±2.3；Val16SOD2轉染組，39.0±5.2。Ala16SOD2和Val16SOD2轉染組SOD2活

15、力分別是轉染對照組的3.51和3.71倍，差異有統(tǒng)計學意義，兩種不同基因型間SOD2活力差異無統(tǒng)計學意義。 (4)100μMt—BHP對未轉染對照、空質粒對照、Ala16型SOD2轉染(突變克隆)、Val16型SOD2轉染(野生克隆)HEI—OC1細胞染毒12h后，DCFH—DA探針檢測各組細胞ROS水平，未轉染對照、空質粒對照組絕大部分細胞均發(fā)出++級明亮熒光，Ala16型和Val16型SOD2轉染組中均只有一半左右細胞發(fā)出—

16、+～+級別的模糊熒光，顯示轉染SOD2可以抑制t—BHP引起HEI—OC1胞內(nèi)ROS水平的上升。AnnexinV\PI雙染HEI—OC1細胞后經(jīng)流式細胞儀測定細胞早期凋亡率和壞死＼晚期凋亡率分別為(％)：未轉染對照組，20.5±2.8和17.9±1.3；Ala16SOD2轉染組，10.4±1.0和6.8±2.8；Val16SOD2轉染組，10.2±0.7和6.3±0.1。和未轉染對照相比，轉染SOD2后，HEI—OC1細胞早期凋亡率和壞

17、死＼晚期凋亡率均下降(P<0.001)，但是其在SOD2兩種基因型之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 研究結論: (1)100μM的t—BHP對HEI—OC1細胞染毒12h可以在不影響細胞外形、增殖能力的前提下較為顯著地提高胞內(nèi)ROS水平，從而模擬噪聲對耳蝸毛細胞的氧化應激損傷。 (2)成功構建了高表達SOD2C47T變異Ala16型和Val16型等位基因的耳蝸毛細胞株。 (3)SOD23.71倍以