重組表達(dá)人乙酰膽堿受體α1亞基胞外域蛋白.pdf

1、煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）分子是一種低聚跨膜糖蛋白，分子量大約為290，000Dalton，由5個同源亞基α2βγδ（胚胎型）或α2βεδ（成人型）組成，形成一個陽離子通道。nAChR存在于神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）處，是引起自身免疫性疾病重癥肌無力（MG）的自身抗原。
　　肌肉nAChR的乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)和主要免疫原區(qū)（MIR）位于α亞基N末端胞外域ECD（α1-210）?？筂IR自身抗體有很高致病力，能導(dǎo)致肌肉中AChR丟失

2、，并激活補(bǔ)體破壞NMJ突觸結(jié)構(gòu)，注入大鼠體內(nèi)能引起嚴(yán)重肌無力癥狀。但MG抗原調(diào)變作用需要多種AChR肽段特異性作用，MIR不是獨(dú)立唯一的抗原決定簇。故若單獨(dú)免疫M(jìn)IR肽段，因?yàn)殡亩味?、免疫位點(diǎn)少、免疫原性弱，不能制備理想的動物模型。普遍的EAMG誘導(dǎo)方法為被動免疫注射MG患者血清或主動免疫電鰩電器官中的AChR。但因MG患者血清采集受限，電鰩不易捕獲且價格昂貴，在AChR提取純化過程中操作復(fù)雜效率不高，使得動物模型難以廣泛復(fù)制。因此，尋

3、找一種簡便、易行的誘導(dǎo)EAMG模型的方法就成為了亟待解決的問題。
　　研究發(fā)現(xiàn)，抗AChR Ab是高親和力的IgG，因此MG的發(fā)病機(jī)制還與B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞有關(guān)系。而AChRαECD包含了MIR和AChR特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞表位，用其作為免疫原可以刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖，激活補(bǔ)體系統(tǒng)。因此，人AChRHα1-207肽段在EAMG模型制備中具有可行性。
　　TE671細(xì)胞屬于人神經(jīng)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，表達(dá)功能性的AChRs

4、，即TE671的AChRs能夠與MG患者的自身抗體和抗肌肉AChRs-mAb發(fā)生交叉反應(yīng)。TE671細(xì)胞中AChR的α亞基與人肌肉AChRα亞基有高度同源性，因此可以通過基因克隆方式重組表達(dá)人肌肉AChR的α亞基ECD蛋白替代天然的AChR作為有效免疫原誘導(dǎo)EAMG。90年代初，Talib就應(yīng)用基因技術(shù)克隆了編碼人源AChRα亞基細(xì)胞外區(qū)域1-210殘基，并成功在大腸桿菌中表達(dá)；Lennon則以該表達(dá)產(chǎn)物成功誘導(dǎo)EAMG Lewis鼠模

5、型。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用分子克隆和表達(dá)技術(shù)重組目的基因的方法己非常成熟，本實(shí)驗(yàn)在Talib的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，直接從TE671細(xì)胞中獲得AChR的α1亞基cDNA序列克隆目的片段。
　　用RT-PCR從TE671細(xì)胞中擴(kuò)增出AChRα1亞基全序列，再PCR擴(kuò)增出ECD基因序列，并將其插入到原核表達(dá)載體pET16b。將重新構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)pLysS，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。得到的包涵體蛋白用Ni2+親

6、和層析柱純化，經(jīng)透析復(fù)性后，用ELISA法檢測蛋白活性。
　　結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小為650bp，與預(yù)計相符；所構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)ECD核苷酸序列正確，并正確插入載體pET16b。用SDS-PAGE來比較誘導(dǎo)前后蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)用IPTG誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)量大大增加。透析復(fù)性后，包涵體蛋白正確折疊且具活性。
　　綜上所述，可通過原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得大量正確折疊的可溶性重組人肌肉AChRα1亞基ECD蛋白，使得誘導(dǎo)EAMG模型的方