Sigma B在單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受抗生素中的作用.pdf

1、[目的]單核細(xì)胞增生李斯特菌是重要的革蘭氏陽(yáng)性食源性致病菌。近年來(lái)的報(bào)道顯示該菌耐受抗生素的能力有不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)。Sigma B(σB，李斯特菌中應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的主要調(diào)控因子)在多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中負(fù)責(zé)壓力應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對(duì)抗生素的耐受。為了探討單核細(xì)胞增生李斯特菌的耐藥機(jī)制，我們對(duì)Sigma B在耐受抗生素中的作用進(jìn)行了初步研究。
　　 [方法]①建立并優(yōu)化檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌耐藥程度，利用噻唑

2、藍(lán)活體染色法(MTT法)檢測(cè)最小抑菌濃度(MIC)；②檢測(cè)和比較單核細(xì)胞增生李斯特菌野生菌株EGDe和其σB缺失突變菌株EGDe△sigB對(duì)盤(pán)尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環(huán)素鹽酸和紅霉素六種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)；③在測(cè)定的MIC的基礎(chǔ)上，利用MTT法比較EGDe和EGDe△sigB在1×MIC、2×MIC和8×MIC的氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平三種抗生素中的生長(zhǎng)活性，繪制生長(zhǎng)遲滯曲線。④采用反轉(zhuǎn)錄

3、PCR(RT-PCR)方法，檢測(cè)EGDe和EGDe△sigB兩種菌株在有和無(wú)利福平脅迫下四個(gè)基因rpoB、rsbU、kat和fri(這四個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)量在革蘭氏陽(yáng)性菌的模式菌枯草芽孢桿菌中與利福平的脅迫正相關(guān)，因此作為單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受利福平的Marker)的表達(dá)量，從轉(zhuǎn)錄水平分析EGDe和EGDe△sigB菌株中這四個(gè)基因與利福平之間的關(guān)系，探究σB介導(dǎo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受抗生素的分子機(jī)制。
　　 [結(jié)

4、果]①EGDe對(duì)盤(pán)尼西林青霉素(0.16μg/mL)、四環(huán)素鹽酸(0.25μg/mL)和硫酸慶大霉素(0.5μg/mL)的MIC高于EGDe△sigB(分別為0.08μg/mL、0.125μg/mL和0.125μg/mL)；四環(huán)素對(duì)EGDe的最小抑菌濃度是對(duì)EGDe△sigB的最小抑菌濃度的兩倍，慶大霉素對(duì)EGDe的最小抑菌濃度是對(duì)EGDe△sigB的最小抑菌濃度的四倍。而此兩種菌株對(duì)氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平的MIC沒(méi)有差別，分別

5、為0.19μg/mL、0.125μg/mL和10.032μg/mL。②比較氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平對(duì)EGDe和EGDe△sigB的生長(zhǎng)遲滯曲線顯示，EGDe△sigB對(duì)這三種抗生素的添加更為敏感，恢復(fù)生長(zhǎng)所需的遲滯時(shí)間更長(zhǎng)，而且其遲滯程度隨著抗生素濃度的增加而增強(qiáng)。③EGDe和EGDe△sigB在有和無(wú)利福平脅迫下四個(gè)基因rpoB、rsbU、kat和fri的轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果顯示：rpoB的表達(dá)不依賴σB，也不受抗生素脅迫的影響，表達(dá)量

6、在兩種菌株中以及有無(wú)抗生素脅迫均穩(wěn)定不變；kat和fri的表達(dá)與σB正相關(guān)，而且受到利福平的誘導(dǎo)；在沒(méi)有利福平時(shí)，EGDe△sigB中rsbU的表達(dá)明顯高于EGDe，當(dāng)給予利福平刺激(4×MIC)，EGDe△sigB中rsbU的表達(dá)下降，EGDe中rsbU的表達(dá)上升，并稍高于EGDe△sigB中rsbU的表達(dá)，暗示rsbU的表達(dá)不僅與利福平脅迫相關(guān)，而且似乎在sigB缺失時(shí)有補(bǔ)償其功能的作用。
　　 [結(jié)論]在多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌如

7、枯草芽孢桿菌和金黃色葡糖球菌中，壓力脅迫應(yīng)答調(diào)控因子Sigma B參與耐受外界多種不利因素。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，σB在單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)抗生素的耐受中起到重要調(diào)節(jié)作用。σB不僅參與耐受作用細(xì)胞膜的抗生素，還參與耐受抑制蛋白質(zhì)合成類抗生素。單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受利福平的分子機(jī)制與枯草芽孢并不完全相同，表明細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受機(jī)制具有種屬特異性。對(duì)不同細(xì)菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，將有助于研發(fā)新的抗菌藥物，以及正確合理地應(yīng)用現(xiàn)有抗菌藥物