PrfA與SigB在單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜形成中的作用.pdf

1、[目的]單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是重要的革蘭氏陽(yáng)性食源性致病菌，易在食品以及各種食品加工、運(yùn)輸和保藏設(shè)備的接觸面形成生物被膜，從而具有更強(qiáng)的抗逆性而難以徹底清除，因此成為食品衛(wèi)生安全的重要隱患。PrfA是LM在侵染宿主細(xì)胞時(shí)毒力基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的最重要的調(diào)控因子，而SigB是LM抵御外界不良環(huán)境時(shí)主要的壓力應(yīng)答因子，由于尚未有文獻(xiàn)直接把PrfA和SigB一這個(gè)LM中調(diào)控絕大多數(shù)毒力基因在宿主

2、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要的蛋白因子和壓力應(yīng)答因子，與LM在宿主外的一種重要存在形式-生物被膜聯(lián)系起來，所以我們的研究將為深入研究LM致病機(jī)理提供新的視點(diǎn)。
　　 [方法]本文的實(shí)驗(yàn)方法可以主要分為三部分。一、對(duì)LM野生株(EGD)、基因缺失菌株(EGDe△prfA、EGDe△sigB、EGD△prfA△sigB)和無害李斯特菌(LI)在BHI培養(yǎng)基比較了各菌株生物被膜形成能力的差別。二、對(duì)PrfA的研究本文主要通過兩組對(duì)比實(shí)驗(yàn)即：1

3、)在常用BHI培養(yǎng)基中，比較研究LM野生株(EGD和EGDe)、PrfA缺失株(EGD△prfA和EGDe△prfA)、無害李斯特菌(Listeria innocua，LI)、攜帶組成性表達(dá)PrfA蛋白的重組無害李斯特菌(LI-pERL3-prfA*)以及重組單核細(xì)胞增生李斯特菌(EGDe△prfA-pERL3-prfA*)，在生物被膜形成能力方面差異；2)比較研究LM野生株EGDe、PrfA缺失株EGDe△prfA、以及攜帶組成性表達(dá)

4、PrfA蛋白的重組單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe△prfA-pERL3-prfA*在不同碳源的培養(yǎng)基中，BHI(Brain Heart Infusion，復(fù)雜多糖作為碳源)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Minimal EssentialMedium簡(jiǎn)稱MM培養(yǎng)基，可添加PTS糖或非PTS糖作為碳源，本文采用的PTS糖為葡萄糖，非PTS糖為甘油)中生物被膜形成的差異，探討LM重要的毒力調(diào)控蛋白PrfA在不同的糖成分作為碳源的培養(yǎng)基中對(duì)生物被膜形成的影響；三

5、、比較了三種菌株LM野生株EGD、sigB缺失株EGDe△sigB和無害李斯特菌(Listeriainnocua，LI)分別在BHI培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基添加0.3％膽汁酸鹽的培養(yǎng)基中，生物被膜形成能力的差異。
　　 [結(jié)果]1)LM野生株具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，而LI形成生物被膜的能力最弱；PrfA和SigB的缺失均能降低LM生物被膜的形成能力；2)在營(yíng)養(yǎng)豐富的常用BHI培養(yǎng)基中，組成性高量表達(dá)PrfA蛋白可以回復(fù)EGDe△

6、prfA的生物被膜形成能力，但對(duì)LI沒有增強(qiáng)作用。在不同糖類作為碳源的培養(yǎng)基中，各菌株在MM培養(yǎng)基中的被膜形成能力要顯著性高于在BHI培養(yǎng)基中相應(yīng)菌株的被膜形成能力；但無論在何種培養(yǎng)基中LM野生株(EGD或EGDe)均具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，PrfA的缺失均能降低LM生物被膜的形成能力；只是在BHI培養(yǎng)基中組成性高量表達(dá)PrfA蛋白可以回復(fù)EGDe△prfA的生物被膜形成能力；而在MM培養(yǎng)基中高量表達(dá)PrfA蛋白不能回復(fù)EGDe△p

7、rfA的生物被膜形成能力，并且在以葡萄糖為唯一碳源的MM培養(yǎng)中，高表達(dá)PrfA菌株的生物被膜形成能力甚至比EGDe△prfA還要低；3)EGD、EGDe△sigB和LI三種菌株無論在填不添加0.3％的膽汁酸鹽的BHI培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出：LI的被膜形成能力最差(幾乎沒有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn))低于EGDeAsigB低于EGD的被膜形成能力，區(qū)別在于：在添加0.3％膽汁酸鹽后，EGD的被膜形成能力較BHI中要提高一些，而EGDe△sigB卻較BHI中

8、被膜形成能力要降低一些，LI幾乎不受影響。
　　 [結(jié)論]1)LM在營(yíng)養(yǎng)極端貧乏的MM培養(yǎng)基(無論添加PTS糖還是非PTS糖)中生物被膜的形成能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在營(yíng)養(yǎng)十分豐富的BHI培養(yǎng)基。但無論在哪種培養(yǎng)基中，PrfA均在LM生物被膜形成中具有重要的促進(jìn)作用，缺失該基因均可降低LM的生物被膜的形成能力，但這種促進(jìn)作用與培養(yǎng)基的成分(我們認(rèn)為主要是糖成分不同)、PrfA數(shù)量與活性均有密切的關(guān)系。2)0.3％的膽汁酸鹽可以在一定程度上