人HBV-HBx定向敲入P53位點大鼠胚胎干細(xì)胞株的建立.pdf

1、全球約3億人感染HBV，近千萬人患慢性乙型肝炎。其中中國是肝癌高發(fā)區(qū)，乙型肝炎流行區(qū)。據(jù)統(tǒng)計，中國占全球HBV表面抗原總攜帶率的50％。80％以上慢性肝炎患者為慢性乙型肝炎病人，80％以上原發(fā)性肝癌的發(fā)生都與乙型肝炎病毒感染相關(guān)。因此乙型肝炎病毒一直都備受研究者關(guān)注，截至目前還沒能完全理解乙型肝炎病毒的變異及致病機(jī)制，其中一方面原因就是缺少有效的動物疾病模型。
　　 乙型肝炎病毒感染具有明顯的種屬和組織特異性，為建立理想的動物模

2、型帶來很大困難。以前多用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型，但與人類肝病發(fā)生有明顯不同。相比之下，大鼠在生理特性等方面更接近于人類，是建立人類疾病的理想動物模型之一。但長期以來，由于無可以生殖傳代的大鼠胚胎干細(xì)胞株，因此無法建立大鼠基因敲入及敲除模型。至2008年建立了真正意義大鼠胚胎干細(xì)胞株(即能生殖傳代的大鼠胚胎干細(xì)胞株)，2010年成功建立首例大鼠基因敲除模型。大鼠P53基因敲除后自發(fā)產(chǎn)生肝癌，有別于小鼠P53基因敲除后很少自發(fā)產(chǎn)生癌癥，這也從

3、側(cè)面說明大鼠更接近于人類。因此本研究通過構(gòu)建載體，電轉(zhuǎn)等建立人HBV＼HBx定向敲入P53位點的大鼠胚胎干細(xì)胞株，為建立人HBV＼HBx定向敲入P53位點的大鼠模型奠定了基礎(chǔ)，便于更好地研究肝癌發(fā)生及發(fā)展規(guī)律，助于發(fā)現(xiàn)HBV＼HBx作用過程中新的信號通路，尋找肝癌新治療靶點，而且可作為藥物評估篩選的模型。
　　 因此本課題就是為了建立人HBV＼HBx定向敲入P53位點的大鼠胚胎干細(xì)胞株，為后續(xù)研究鑒定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容包括基因打靶載

4、體的構(gòu)建，目的打靶細(xì)胞系的篩選，嵌合鼠制備及對動物模型進(jìn)行相關(guān)表型分析。
　　 構(gòu)建基因打靶載體時，為了以后進(jìn)行相關(guān)基因打靶方便，我們先是建立了包括嘌呤霉素和白喉毒素在內(nèi)的通用載體，然后再通用載體的基礎(chǔ)上加兩端同源臂，最后在引入的多克隆位點處加HBV全基因組或X蛋白基因序列。構(gòu)建載體過程中每步都通過三組以上酶切體系跑電泳鑒定，通用載體用測序方式鑒定。
　　 獲得的目的質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入已建系好的DAc8大鼠胚胎干細(xì)胞系