miR-27B-5p促進肝細胞向肝癌干樣細胞轉化及其機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肝癌是世界上最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，其療效差，復發(fā)率高，預后不良，原因可能與腫瘤中存在的一小部分具有自我更新和多向分化能力的腫瘤干細胞有關。miRNAs是一類單鏈非編碼RNA，其長約20-24個核苷酸，在轉錄后水平發(fā)揮調節(jié)基因的作用。近年來，已經(jīng)證實miRNA在腫瘤干細胞及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，它們可能作為腫瘤潛在的分子治療靶點。在前期研究中，我們已經(jīng)利用miRNA芯片技術篩選出肝癌干樣細胞與肝

2、癌細胞中miRNAs的差異表達譜。接下來我們旨在從miRNAs的差異表達譜中找出與肝癌干樣細胞相關的miRNA，并研究其對肝癌細胞及肝癌干樣細胞的影響及其作用機制，為肝癌的診治提供新的方向。
　　方法:
　　第一部分:參與肝癌細胞向肝癌干樣細胞轉化過程miRNA的篩選及驗證
　　1應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chainreaction，RT-PCR)方法在

3、Huh7肝癌細胞及肝癌干樣細胞中驗證部分芯片結果。
　　2應用RT-PCR方法在肝癌組織及癌旁肝組織中驗證部分芯片結果。
　　第二部分:miR-27b-5p對肝癌細胞向肝癌干樣細胞轉化的腫瘤生物學功能研究
　　1應用慢病毒感染技術構建miR-27b-5p過表達的肝癌細胞。
　　2應用CCK-8細胞增殖實驗、劃痕實驗、克隆形成實驗、Transwell細胞侵襲實驗等實驗方法和技術檢測miR-27b-5p在體外實驗中對

4、肝癌細胞生物學的影響。
　　3應用單細胞成球實驗、RT-PCR等實驗方法和技術檢測miR-27b-5p在體外實驗中對肝癌干樣細胞干性的影響。
　　第三部分:miR-27b-5p促進肝癌細胞向肝癌干樣細胞轉化的機制研究
　　1通過DIANA、MICRORNA、MIRDB、PICTAR、TargetMiner、RNA22等生物信息學軟件預測miR-27b-5p調控的下游靶基因。
　　2應用定量RT-PCR方法檢測mi

5、R-27b-5p與靶基因在mRNA水平上的相關性。
　　3應用Western Blot方法檢測miR-27b-5p與靶基因在蛋白水平上的相關性。
　　4應用雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-27b-5p對靶基因的直接調控作用。
　　結果:
　　第一部分:參與肝癌細胞向肝癌干樣細胞轉化過程miRNA的篩選及驗證
　　1在前期研究中，通過miRNA芯片技術初步獲得肝癌干樣細胞與肝癌細胞miRNAs的差異表達譜，

6、對芯片結果進行分析，肝癌干樣細胞與肝癌細胞相比，差異十倍以上的miRNA有35個，上調10個，下調25個，運用定量RT-PCR方法檢測miR-27b-5p在Huh7肝癌細胞及肝癌干樣細胞中的表達與芯片結果一致。
　　2運用定量RT-PCR方法檢測miR-27b-5p在肝癌組織及癌旁肝組織中的表達與芯片結果一致。
　　第二部分:miR-27b-5p對肝癌細胞向肝癌干樣細胞轉化的腫瘤生物學功能研究
　　1 miR-27b-

7、5p過表達慢病毒感染Huh7肝癌細胞，感染72h后，miR-27b-5p組和對照慢病毒(NC)組均出現(xiàn)明顯綠色熒光蛋白表達，提示慢病毒感染成功。將感染后的肝癌細胞提取總RNA，進一步行定量RT-PCR檢測，miR-27b-5p組目的基因的表達明顯高于NC組和空白對照(Blank)組，具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明過表達miR-27b-5p成功。
　　2通過慢病毒載體在肝癌細胞中過表達miR-27b-5p成功后，進行一系

8、列腫瘤細胞生物學行為檢測:CCK-8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b-5p可促進Huh7肝癌細胞的增殖（P＜0.05）;平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b-5p可促進Huh7肝癌細胞的克隆形成(P＜0.01);劃痕實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b-5p可促進Huh7肝癌細胞的遷移(P＜0.05);Transwell細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b-5p可促進Huh7肝癌細胞的侵襲(P＜0.01)。此外，對過表達miR-27b-5p

9、的腫瘤細胞在干性方面的變化進行檢測:單細胞成球實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b-5p可促進肝癌干樣細胞的自我更新（P＜0.01）。定量RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b-5p可促進肝癌細胞干性基因的表達(P＜0.01)。
　　第三部分:miR-27b-5p促進肝癌細胞向肝癌干樣細胞轉化的機制研究
　　1通過DIANA、MICRORNA等生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn)FOXO1可能是miR-27b-5p的下游靶點。FOXO1已被證實

10、是哺乳動物細胞中重要的抑癌基因。
　　2定量RT-PCR結果顯示過表達miR-27b-5p肝癌細胞中的FOXO1mRNA表達水平相比于NC組和Blank組肝癌細胞明顯降低，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　3 Western Blot結果顯示過表達miR-27b-5p肝癌細胞的FOXO1蛋白表達水平相比于NC組和Blank組肝癌細胞明顯降低，而NC組與Blank組之間無明顯差異。
　　4雙螢光素酶報告基因實驗結果顯

11、示相對于FOXO1-Mut組，miR-27b-5pmimics的作用后，F(xiàn)OXO1-WT組的FOXO1-3'UTR質粒的表達趨勢降低。
　　結論:
　　1 miR-27b-5p不僅可促進肝癌細胞的增殖、侵襲與遷移，而且可促進肝癌干樣細胞的自我更新與肝癌細胞干性基因的表達。
　　2生物信息學軟件預測FOXO1可能是miR-27b-5p的下游靶點。
　　3 miR-27b-5p與FOXO1的表達具有顯著相關性，且通過