應用新型熒光顯微技術(shù)研究循環(huán)癌細胞和TGF-β在成纖維細胞分化中的作用.pdf

1、第一部分應用活體流式細胞儀技術(shù)研究前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移以及巨噬細胞對循環(huán)前列腺癌細胞的作用
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是一個非常復雜的多步驟過程，也是導致癌癥患者低存活率的原因。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞首先需要脫離腫瘤的原發(fā)灶，然后侵入周圍的血管或淋巴管中，隨著血液或淋巴液遷移到體內(nèi)的其他區(qū)域并進一步形成轉(zhuǎn)移灶。由于血液循環(huán)系統(tǒng)貫穿全身，所以通過血循環(huán)的癌細胞可能在身體的任何部位建立新的轉(zhuǎn)移灶。在本研究中，我們使用新興的活體流式細胞儀技術(shù)來研究前列

2、腺癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能與其在循環(huán)系統(tǒng)中消逝動力學之間的關(guān)系?；铙w流式細胞儀能夠在體地對小動物體內(nèi)的循環(huán)熒光標記細胞的數(shù)目和流動特性進行檢測和定量。我們發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的前列腺癌細胞系PC-3比LNCaP能更快地從循環(huán)系統(tǒng)中消逝。在尾靜脈注射前列腺癌細胞后的第1小時的時刻，超過70％的PC-3從循環(huán)中消逝了，相比之下，只有不到30％的LNCaP從循環(huán)中消逝了。激光共聚焦顯微成像顯示，在注射前列腺癌細胞后的第1和第5小時的時刻，小鼠顱骨下的骨

3、髓區(qū)域中的DiD標記PC-3數(shù)量明顯多于DiD標記LNCaP細胞。前列腺癌細胞的小鼠動力學差異可能會為我們研究前列腺癌的早期轉(zhuǎn)移提供新的視角。
　　巨噬細胞可能直接參與腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移，但目前人們對巨噬細胞是如何影響循環(huán)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程尚不完全清楚。我們利用活體流式細胞儀研究了循環(huán)前列腺癌細胞在小鼠體內(nèi)的消逝過程，以及通過脂質(zhì)體包裹的氯膦酸二鈉清除巨噬細胞后的循環(huán)前列腺癌細胞消逝動力學的改變情況。實驗結(jié)果顯示在巨噬細胞被清除的小

4、鼠（實驗組）和正常小鼠（對照組）中分別通過尾靜脈注射前列腺癌細胞PC-3后，循環(huán)PC-3細胞在實驗組和對照組中的消逝動力學是不同的。相比對照組，巨噬細胞被清除的實驗小鼠體內(nèi)的循環(huán)PC-3細胞在血液循環(huán)中的消逝速度較慢。該消逝動力學的差異意味著清除巨噬細胞將有助于前列腺癌細胞在循環(huán)系統(tǒng)中停留更長的時間。此外，通過體外成像實驗我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可以捕獲，吞噬和消化PC-3細胞。因此，巨噬細胞的吞噬作用可能是導致循環(huán)腫瘤細胞的消逝動力學改變的一

5、個重要原因。我們的方法對研究小動物模型中的巨噬細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系有重要裨益。
　　第二部分應用雙光子熒光顯微成像技術(shù)和生物圖像信息學方法研究膠原蛋白支架中成纖維細胞的TGF-β分子信號通路
　　為了進一步學習新的熒光顯微成像技術(shù)，本人受國家留學基金委的資助，于2010年11月開始，前往世界著名學府美國麻省理工學院的Peter T.C.So教授實驗室，開展了為期18個月的科學研究。
　　細胞通過信號轉(zhuǎn)導通路，蛋白質(zhì)級聯(lián)

6、反應和各種小分子來感受外界環(huán)境并作出相應反應。目前大部分細胞信號通路知識都是通過經(jīng)典的生化和遺傳學操作得來的，但是隨著所研究生物系統(tǒng)的復雜性不斷增加，要求人們開辟更多新方法來研究細胞通路并加速實驗進度。雙光子熒光顯微成像技術(shù)具有高分辨率、穿透能力強、光損傷小的優(yōu)點，因此被廣泛地應用于生物活細胞和組織的長時間三維成像。生物圖像信息學方法通過綜合細胞的基因操作，大規(guī)模成像，圖像處理和統(tǒng)計學來研究細胞中復雜的信號轉(zhuǎn)導通路，進而揭示相關(guān)的生理過

7、程及藥理作用機制。生物圖像信息學現(xiàn)已被用于研究培養(yǎng)在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)皿中的細胞的生物問題。
　　成纖維細胞在傷口愈合和許多纖維化的疾病中起重要作用。TGF-β調(diào)節(jié)成纖維細胞分化過程并影響細胞的形態(tài)和細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用，TGF-β誘導的信號通路會影響傷口牽拉和瘢痕形成，進而顯著影響受傷器官中傷口愈合的效果。多孔膠原蛋白支架作為組織的細胞外基質(zhì)類似物被成功應用在臨床上對受傷器官進行誘導性再生過程。我們通過慢病毒介導的shRNA對成

8、纖維細胞的TGF-β/SMAD信號通路中的各個成分進行干擾，并應用實驗室搭建的16-通道光譜多（雙）光子熒光顯微鏡，結(jié)合新的針對細胞-細胞外基質(zhì)三維系統(tǒng)的生物圖像信息學方法，來研究植于多孔膠原蛋白支架中的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞過程中TGF-β信號通路。
　　通過對成纖維細胞的基于單細胞形態(tài)學以及細胞-多孔膠原蛋白支架系統(tǒng)的雙光子熒光顯微成像數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析，并通過生化免疫印跡實驗作為輔助驗證手段，我們推斷出:相對于TGF

9、-β3，TGF-β1在介導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞過程中發(fā)揮著更重要的作用;SMAD1和SMAD3在TGF-β1介導的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞過程中發(fā)揮重要作用;SMAD1和SMAD3是通過不同的方式在TGF-β1介導的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞過程中發(fā)揮作用的。這些推測與其他文獻中通過生化或遺傳方法得到的結(jié)果是非常吻合的。因此，我們這里所建立的基于雙光子熒光顯微成像技術(shù)和生物圖像信息學方法能很好地應用于研究細胞-細胞外基質(zhì)（