P311和TGF-β1間相互作用對成纖維細(xì)胞功能的影響.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻騽?chuàng)傷后皮膚組織的病理性愈合可導(dǎo)致增生性瘢痕的形成，其主要表現(xiàn)為突出皮面、形狀不規(guī)則的紅色硬質(zhì)斑塊。增生性瘢痕不僅影響外觀，對患者造成嚴(yán)重的心理傷害，還可攣縮導(dǎo)致受傷部位發(fā)生功能障礙，影響患者的生活質(zhì)量。盡管對于創(chuàng)面愈合的認(rèn)識不斷加深，但是增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明，臨床上也沒有有效的預(yù)防和治療措施。隨著人們對形象和生活質(zhì)量追求的不斷提高，增生性瘢痕的治療與預(yù)防成為近年來的研究熱點。
　　大量研究表明增生性瘢痕的主要

2、病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，而皮膚(肌)成纖維細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解有重要的調(diào)節(jié)作用。在創(chuàng)面愈合的過程中，皮膚成纖維細(xì)胞大量增殖，并分化為肌成纖維細(xì)胞，合成以Ⅰ型膠原為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)，一旦細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解的平衡被打破，即可造成細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積。因此研究影響(肌)成纖維功能的分子及其作用機(jī)制對于增生性瘢痕形成機(jī)制的認(rèn)識尤為關(guān)鍵。
　　TGF-β1是多種器官纖維化過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在創(chuàng)面愈合過程中表達(dá)增高，

3、并對(肌)成纖維細(xì)胞的功能產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)(肌)成纖維細(xì)胞合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，并抑制膠原降解酶類的合成，而使細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。而我們課題組前期通過基因芯片等實驗發(fā)現(xiàn)P311在增生性瘢痕中的表達(dá)明顯高于正常皮膚，提示P311在創(chuàng)面愈合以及增生性瘢痕的形成過程中可能發(fā)揮著重要作用。在此基礎(chǔ)上，我們以P311為切入點，通過酵母雙雜交和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)篩選出真核啟動因子6(eukaryotic in

4、itiation factor6，eIF6)是P311的胞內(nèi)相互作用蛋白。在隨后的研究中，我們又發(fā)現(xiàn)eIF6減少可以促進(jìn)TGF-β1的轉(zhuǎn)錄啟動，而增加TGF-β1的表達(dá)量，進(jìn)而通過TGF-β1-Smad信號通路促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的分化，最終促進(jìn)增生性瘢痕的形成。于是，下一步我們想探究eIF6的相互作用蛋白——P311，在增生性瘢痕的形成以及肌成纖維細(xì)胞的分化過程中的調(diào)節(jié)作用，以及與TGF-β1是否存在聯(lián)系。
　　目的：為了探究成纖維

5、細(xì)胞中P311和TGF-β1的相互作用關(guān)系，及其對成纖維細(xì)胞功能的影響，本實驗以P311野生型和基因敲除型新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞為目標(biāo)展開研究。
　　方法：
　　1、P311腺病毒表達(dá)載體及對照載體的構(gòu)建、包裝、擴(kuò)增、純化和滴度測定
　　將本實驗室前期構(gòu)建的pDsRed-P311質(zhì)粒雙酶切后，與穿梭質(zhì)粒pAdTrack連接，將穿梭載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，鑒定篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取。將線性化的穿梭

6、質(zhì)粒pAdTrack-CMV-P311和pAdTrack-CMV分別轉(zhuǎn)化至含pAdEasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，酶切鑒定成功后，在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝、擴(kuò)增，應(yīng)用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行病毒的純化和滴度測定。
　　2、新生小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及基因型的鑒定
　　取P311野生型和P311基因敲除型C57BL/6新生小鼠各5只，消毒、清洗后斷頸處死，分離皮膚并剪塊，在0.5g/l Dis

7、paseⅡ中浸泡過夜，分離出真皮組織后剪碎，加入0.5％胰蛋白酶溶液37℃消化10min，終止消化后離心獲得細(xì)胞及組織沉淀，接種于培養(yǎng)瓶中37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時換液、傳代，采用第2代成纖維細(xì)胞完成本實驗，每個實驗重復(fù)3次。對剪取的鼠尾利用試劑盒提取基因組DNA，通過P311相關(guān)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定相應(yīng)的基因型。
　　3、P311過表達(dá)對成纖維細(xì)胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響
　　取P311野生型成纖維細(xì)

8、胞，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和P311過表達(dá)組，分別加入等量的空載腺病毒和P311腺病毒表達(dá)載體。兩組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48h后，采用實時熒光定量RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測兩組成纖維細(xì)胞的TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達(dá)量。
　　4、P311基因敲除對成纖維細(xì)胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響
　　取P311野生型和P311基因敲除型成纖維細(xì)胞，待培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80％～90％時，采

9、用實時熒光定量RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測兩種成纖維細(xì)胞的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA和蛋白的表達(dá)量。
　　5、TGF-β1對成纖維細(xì)胞中P311mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響
　　將P311野生型成纖維細(xì)胞饑餓處理后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為6組，分別加入濃度為0、5、10、15、20和25ng/ml的TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測6組成纖維細(xì)胞的P311的mRNA表達(dá)

10、量;免疫熒光法檢測空白對照組和10ng/mlTGF-β1組成纖維細(xì)胞的P311蛋白表達(dá)。
　　6、TGF-β1對P311野生型和基因敲除型成纖維細(xì)胞α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響
　　將P311野生型成纖維細(xì)胞饑餓處理后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為空白對照組和10ng/mlTGF-β1組兩組，分別加入濃度為0和10ng/ml的TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，采用實時熒光定量RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組成纖維細(xì)胞的α-

11、SMA和Ⅰ型膠原的mRNA和蛋白的表達(dá)量。取P311基因敲除型成纖維細(xì)胞，同前分組、處理及檢測指標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　1、P311腺病毒表達(dá)載體及對照載體的構(gòu)建、包裝、擴(kuò)增、純化和滴度測定
　　經(jīng)過多步的酶切和PCR鑒定，成功構(gòu)建了P311腺病毒表達(dá)載體和對照空載體，在HEK293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增，再進(jìn)行純化后，測定滴度為109PFU/ml。
　　2、新生小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及基因型的鑒定
　　

12、順利分離、培養(yǎng)了P311野生型和基因敲除型新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞?；蛐丸b定結(jié)果表明，小鼠的基因型與預(yù)期相一致。
　　3、P311過表達(dá)對成纖維細(xì)胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響
　　P311過表達(dá)組的成纖維細(xì)胞之P311mRNA表達(dá)水平較空載體對照組的成纖維細(xì)胞增高近30萬倍(t=9.942，P＜0.001)。P311過表達(dá)組的成纖維細(xì)胞之TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原的mRNA，以及TGF-β1前體、T

13、GF-β1活化態(tài)、α-SMA、Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)量均較空載對照組的成纖維細(xì)胞明顯升高(t值為8.192～49.090，P值均小于0.001)。
　　4、P311基因敲除對成纖維細(xì)胞TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響
　　P311基因敲除型成纖維細(xì)胞的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)量較P311野生型成纖維細(xì)胞明顯降低(t值為8.157～22.270，P值均小于0.01)。P311基因敲除型成纖維細(xì)胞

14、的TGF-β1前體、α-SMA、Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)量較P311野生型成纖維細(xì)胞明顯降低(t值為2.995～12.600，P值均小于0.05)，兩組成纖維細(xì)胞的TGF-β1活化態(tài)蛋白表達(dá)量無明顯差異(t=1.070，P＞0.05)。
　　5、TGF-β1對成纖維細(xì)胞中P311mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響
　　空白對照組及5、10、15、20和25ng/mlTGF-β1組的成纖維細(xì)胞之P311mRNA表達(dá)量分別為1.28±0.4

15、4、3.61±0.91、6.64±0.92、6.58±1.04、1.79±0.31、0.16±0.06。與空白對照組的成纖維細(xì)胞比較，10ng/ml和15ng/mlTGF-β1組的成纖維細(xì)胞的P311mRNA表達(dá)量明顯增高(t值分別為5.630和4.710，P值均小于0.001);25ng/mlTGF-β1組的成纖維細(xì)胞之P311 mRNA表達(dá)量明顯降低(t=2.509，P＜0.01)。5、20ng/mlTGF-β1組的成纖維細(xì)胞之P3

16、11mRNA表達(dá)量與空白對照組的成纖維細(xì)胞相近(t值分別為2.302和0.955，P值均大于0.05)。10ng/mlTGF-β1之P311熒光明顯強于空白對照組成纖維細(xì)胞。
　　6、TGF-β1對P311野生型和基因敲除型成纖維細(xì)胞α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響
　　10ng/mlTGF-β1組的P311野生型成纖維細(xì)胞的α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA和蛋白表達(dá)量均較空白對照組明顯升高(t值為3.523～14.290，P＜

17、0.05或P＜0.01)。10ng/mlTGF-β1組的P311基因敲除型成纖維細(xì)胞的α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA和蛋白表達(dá)量均較空白對照組P311基因敲除型成纖維細(xì)胞有不同程度的升高(t值為4.895～14.870，P＜0.05或P＜0.01)。P311野生型成纖維細(xì)胞施以外源性TGF-β1處理后，α-SMA表達(dá)的增加量高于P311基因敲除型成纖維細(xì)胞，而Ⅰ型膠原表達(dá)的增加量則相近。
　　結(jié)論：
　　1、P311可以促進(jìn)