雞樅菌與淡色庫蚊及家蠅中漆酶編碼基因的克隆與表達.pdf

1、漆酶(EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，普遍存在于真菌(特別是白腐真菌)、植物、昆蟲和細菌中。漆酶的作用底物廣泛，有250種左右，主要以酚類和芳香類化合物為主。漆酶在木質(zhì)素降解、制漿造紙生物漂白、環(huán)境保護、食品及飲料加工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文以黑翅土白蟻共生雞樅(實為“土”字旁+“從”)菌、淡色庫蚊和家蠅為材料，研究了雞樅菌中漆酶的性質(zhì)，產(chǎn)酶誘導(dǎo)和漆酶基因的克隆與異源表達及淡色庫蚊和家蠅中漆酶基因的克隆與表達。主要結(jié)

2、果如下： 1.分析了黑翅土白蟻工蟻腸道、若蟻、雞樅菌和菌圃中漆酶的分布，研究了溫度、pH值和抑制劑對這些漆酶的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，雞樅菌具有最高的漆酶活性，達到13.36U/g；其次為菌圃4.24U/g；在工蟻腸道中，漆酶的活性相對較低，只有1.05U/g；而若蟻中幾乎檢測不到漆酶的活性。這些漆酶在酸性條件(pH3.0-3.5)下表現(xiàn)出最高的活性和較強的熱穩(wěn)定性。一些化合物，如L-半胱氨酸、DTT和氟離子，對漆酶具有強烈的抑制作用。

3、這些結(jié)果表明，雞樅菌可能通過分泌漆酶到菌圃來降解菌圃中的木質(zhì)素，從而改善菌圃作為工蟻食物的品質(zhì)。 2.利用不同培養(yǎng)基在不同CO2濃度環(huán)境下對雞樅菌進行了培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PDA、CDA、PD和KB(高氮/低氮)培養(yǎng)基中，雞樅菌都能生長。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，這些真菌的形態(tài)發(fā)生了改變；在PDA和KB(低氮)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的雞樅菌顯示出了較低的漆酶活性，兩者的活性分別為1.98U/g和0.73U/g。在CO2濃度為4％、10％和15％的環(huán)境中

4、，雞樅菌均能正常生長，并具有低的漆酶活性，但在CO2濃度為25％、50％和75％的環(huán)境中不能正常生長。這些結(jié)果表明，通過人工方式培養(yǎng)可培養(yǎng)出具漆酶活性的共生真菌。 3.通過RACE方法從雞樅菌中克隆出編碼漆酶的基因并在大腸桿菌中對其進行了表達。雞樅菌中編碼漆酶的基因(talcc)全長為2295bp，編碼1551bp的開放閱讀框(ORF)。全長cDNA共由15個外顯子組成，預(yù)測編碼517個氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為55.8KDa

5、，等電點(pI)為5.92。比對發(fā)現(xiàn)，雞樅菌漆酶TaLCC與Cyathusbulleri真菌中漆酶CbLCC的序列最為相似，達到67％；而與來自同屬真菌Termitomyces的漆酶LCC1-2序列的相似度只有47％。同時，把含原始信號肽的talcccDNA克隆到pET-28a表達載體中，然后導(dǎo)入BL21大腸桿菌中，IPTG誘導(dǎo)表達后得到一條60kDa左右的粗條帶，進一步通過western印跡分析鑒定，此條帶為重組漆酶蛋白。但經(jīng)酶活測定

6、發(fā)現(xiàn)，純化的重組蛋白未表現(xiàn)出漆酶活性。 4.通過RACE方法從淡色庫蚊和家蠅中克隆漆酶基因。實驗發(fā)現(xiàn)，淡色庫蚊漆酶基因(CpLac2)全長由2289個堿基組成，預(yù)測編碼762個氨基酸，預(yù)測的蛋白含有31個氨基酸的信號肽，說明為分泌型蛋白，其分子量為81.2kDa，等電點(pI)為6.21。與其他昆蟲漆酶比對后發(fā)現(xiàn)，CpLac2與昆蟲漆酶.2基因存在75％-88％的相似性，屬于漆酶-2基因。家蠅漆酶基因片斷為1482bp，此片斷也

7、與漆酶-2基因存在極高的相似性，也屬于漆酶-2基因。 5.運用RT-PCR和熒光實時PCR分析了CpLac2的表達發(fā)育模型及淡色庫蚊敏感與抗氰戊菊酯品系的CpLac2表達差異。結(jié)果表明，CpLac2基因在淡色庫蚊的卵、四齡幼蟲和蛹中大量表達，說明CpLac2基因可能參與了淡色庫蚊卵鞘、蛹和成蟲體表的鞣化過程；CpLac2基因在抗氰戊菊酯淡色庫蚊品系中的表達顯著高于在敏感品系中的，預(yù)示著它可能參與了淡色庫蚊對氰戊菊酯抗性的形成，因