脂肪干細(xì)胞來(lái)源施萬(wàn)細(xì)胞在大鼠腦損傷中的應(yīng)用.pdf

1、背景:施萬(wàn)細(xì)胞(schwann cells,SCs)在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)軸突損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,部分學(xué)者提出用施萬(wàn)細(xì)胞來(lái)修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。但是由于施萬(wàn)細(xì)胞為終末細(xì)胞,其來(lái)源和增殖能力有限、體外培養(yǎng)較困難,故很難獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞,并不能完全滿足種子細(xì)胞的要求和特點(diǎn)。脂肪干細(xì)胞(adipose derived(Mesenchymal)stem cells,ADSCs)具有來(lái)源廣,取材方便,含量較豐富,在體

2、外較易培養(yǎng)增殖等優(yōu)點(diǎn),使得它被越來(lái)越多人重視,成為新的組織工程種子細(xì)胞來(lái)源。
　　目的:本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)SD(Sprague-Dawley)大鼠腹股溝脂肪的提取和培養(yǎng),獲得脂肪干細(xì)胞,并體外誘導(dǎo)其分化成類(lèi)施萬(wàn)細(xì)胞。然后用脂肪干細(xì)胞來(lái)源施萬(wàn)細(xì)胞移植治療運(yùn)動(dòng)皮層損傷大鼠偏癱模型,并初步探討其對(duì)腦損傷修復(fù)的機(jī)制。
　　方法:采用酶消化法,取SD大鼠腹股溝脂肪組織,以加有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的低

3、糖α-MEM培養(yǎng)基,在5％CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),傳代。采用第3-5代亞融合狀態(tài)細(xì)胞,通過(guò)β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME),全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA),血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF),福斯高林(forskolin,FSK),堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth

4、factor,bFGF),神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子-2(glial growth factor-2,GGF-2)等的序貫作用下,誘導(dǎo)細(xì)胞分化。并行免疫熒光檢測(cè)施萬(wàn)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),S-100和P75。于此同時(shí),在顯微鏡下?lián)p毀大鼠左側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層,制作出對(duì)側(cè)偏癱大鼠模型。然后將獲得的分化細(xì)胞移植到偏癱大鼠受損腦皮層局部,觀察試驗(yàn)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況并分別采

5、用Longa評(píng)分和Faden評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)程度。進(jìn)一步,我們對(duì)部分大鼠海馬區(qū)組織進(jìn)行nestin染色,了解移植后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的變化。對(duì)部分大鼠受損側(cè)腦組織進(jìn)行Western Blotting,檢測(cè)其中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF),腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),caspase3,Nestin及Neurocan的表達(dá),以定量了解移植

6、后受損環(huán)境中這些因子的表達(dá)情況。此外,利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將綠色熒光蛋白標(biāo)記移植細(xì)胞,移植后用GFAP標(biāo)記反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞,從而觀察移植細(xì)胞與膠質(zhì)疤痕之間的關(guān)系。最后采用SPSS18.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:成功從SD大鼠腹股溝脂肪組織中分離出ADSCs,在體外培養(yǎng)獲得增殖和傳代。誘導(dǎo)分化出的類(lèi)施萬(wàn)細(xì)胞,呈現(xiàn)典型施萬(wàn)細(xì)胞形態(tài),并表達(dá)施萬(wàn)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP,S100以及P75。依照我們的方法搗損運(yùn)動(dòng)皮層,能建立對(duì)側(cè)不

7、全偏癱模型。將ADSCs來(lái)源施萬(wàn)細(xì)胞移植后,發(fā)現(xiàn)ADSCs-sCs能夠大幅度改善偏癱大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),ADSCs-SCs可以動(dòng)員內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖,促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF,BDNF的分泌,抑制凋亡,減少膠質(zhì)疤痕形成,減少抑制性因子Neurocan的分泌。結(jié)果與對(duì)照組比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.ADSCs-SCs移植大大改善運(yùn)動(dòng)皮層損傷的偏癱大鼠模型術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能。2.ADSCs-SCs在體內(nèi)可以促進(jìn)內(nèi)源性神