HIF-1α氧依賴(lài)降解區(qū)域融合多肽對(duì)體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧的保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　 缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic Encephalopathy,HIE)是由于各種圍生期因素引起的缺氧和腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒和新生兒的腦損傷,臨床出現(xiàn)一系列腦病表現(xiàn),不僅嚴(yán)重威脅著新生兒的生命,而且是新生兒期后病殘兒中最常見(jiàn)的病因之一,因此HIE的防治是當(dāng)今全球范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。造成新生兒缺氧缺血性腦病的原因是多方面的,其中超過(guò)2/3發(fā)生在宮內(nèi),母體、胎盤(pán)及胎兒因素均可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)缺氧缺血,

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)缺氧缺血最為敏感,為減少缺氧缺血對(duì)胎兒腦組織的損害,新生兒缺氧缺血性腦病的防治要盡可能做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。從胎兒醫(yī)學(xué)的角度,HIE的防治應(yīng)從宮內(nèi)做起,近年來(lái),胎兒宮內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)損傷及其防治越來(lái)越受到重視。是否可以通過(guò)在宮內(nèi)給藥達(dá)到早期進(jìn)行腦保護(hù)性治療是世界范圍內(nèi)倍受矚目的課題。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活

3、性的核蛋白,能夠與靶基因相結(jié)合,通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,使機(jī)體對(duì)缺氧、缺血產(chǎn)生適應(yīng)反應(yīng)。HIF-1的靶基因包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)、葡萄糖載體蛋白-1(GLUT-1)、促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)、神經(jīng)一氧化氮合酶、糖分解酶、亞鐵血紅素加氧酶等,參與血管形成、血管收縮反應(yīng)、葡萄糖和能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞增殖和分化、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多種

4、生理過(guò)程的調(diào)節(jié),在缺氧缺血腦損傷后的血管生成、能量代謝的改善及抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用,是重要的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)因子,能夠有效的減輕新生兒缺氧缺血性腦病的損傷程度。對(duì)HIF-1在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)及調(diào)控的深入研究,有望為胎兒宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷的防治提供一種新的途徑。
　　 HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β以異源二聚體形式組成。其活性主要由HIF-1α亞單位調(diào)節(jié)。HIF-1α在氧含量正常的情況下,通過(guò)脯氨酸羥化酶區(qū)域(P

5、rolylhydroxylase domain,PHD)酶使HIF-1α氧依賴(lài)的降解區(qū)域(ODD)的脯氨酸殘基發(fā)生羥基化作用。羥基化的脯氨酸殘基能被VHL蛋白(von Hippel-Lindauprotein,pVHL)的β區(qū)識(shí)別,形成泛素蛋白酶復(fù)合體。VHL蛋白是泛素連接酶復(fù)合體的組分之一,在蛋白因子的參與下,引導(dǎo)HIF-1α進(jìn)入泛素.蛋白酶體途徑降解,導(dǎo)致HIF-1失活,進(jìn)而HIF-1靶基因轉(zhuǎn)錄被阻斷。Willam等利用基因工程技術(shù)

6、合成的HIF-1αODD融合多肽,常氧下能阻斷HIF-1α的降解,引起HIF-1的聚積,誘導(dǎo)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄,該融合多肽能指派HIF-1全部的生理反應(yīng),局部應(yīng)用這些多肽能夠誘導(dǎo)包括葡萄糖吸收和血管形成等多種復(fù)雜的生理學(xué)過(guò)程。因此這些多肽或基于它們的分子,是研究HIF-1介導(dǎo)的缺氧適應(yīng)反應(yīng)的有用工具,為缺氧缺血性疾病的治療提供了一種新的思路。
　　 目的：
　　 為了研究HIF-1αODD融合多肽對(duì)神經(jīng)元缺氧的保護(hù)作用,我

7、們首先進(jìn)行了新生大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)、鑒定,并制作了皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧模型,觀察了HIF-1αODD融合多肽對(duì)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的影響,并通過(guò)研究HIF-1αODD融合多肽對(duì)HIF-1α、PHD2和HIF1的靶基因VEGF表達(dá)的影響,深入探討該融合多肽的作用機(jī)制,進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。探索HIF-1αODD融合多肽應(yīng)用于宮內(nèi)缺氧缺血的治療的可能性,為胎兒宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷開(kāi)辟新的治療途徑。
　　 方法

8、：
　　 1、新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)、鑒定及缺氧模型的建立
　　 利用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的原代細(xì)胞培養(yǎng);運(yùn)用免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定,檢測(cè)體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元的純度;運(yùn)用厭氧培養(yǎng)箱建立神經(jīng)元的缺氧模型。
　　 2、HIF-1αODD融合多肽降低缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡
　　 以神經(jīng)元對(duì)缺氧最為敏感的第0-8小時(shí)為研究的時(shí)間窗,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)正常

9、對(duì)照組、缺氧對(duì)照組以及缺氧不同時(shí)間加入不同劑量HIF-1αODD融合多肽神經(jīng)元細(xì)胞的生存率;應(yīng)用DAPI染色法和原位末端標(biāo)記法(TUNEL)法檢測(cè)神經(jīng)元缺氧不同時(shí)間的凋亡率。
　　 3、HIF-1αODD融合多肽對(duì)缺氧皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α、VEGF和PHD2表達(dá)的影響
　　 利用免疫組織化學(xué)法和Western Blot方法檢測(cè)正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組以及加入HIF-1αODD融合多肽治療組神經(jīng)元中HIF-1α、PHD2、

10、VEGF蛋白水平的表達(dá)。利用Real time PCR檢測(cè)正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組以及治療組HIF-1α、PHD2、VEGF在神經(jīng)元基因水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)、鑒定及缺氧模型的建立
　　 運(yùn)用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)成功培養(yǎng)了純度95％以上的新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元;運(yùn)用神經(jīng)元特異性烯醇化酶進(jìn)行了神經(jīng)元的鑒定;利用厭氧箱制備了神經(jīng)元的缺氧模型。
　　 2、HIF-1αODD融合多肽降低

11、缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡
　　 在神經(jīng)元缺氧敏感的0-8小時(shí)內(nèi),融合多肽能顯著提高神經(jīng)元的生存率,降低缺氧引起的神經(jīng)元的凋亡,缺氧24小時(shí)前給藥與缺氧即刻給藥對(duì)神經(jīng)元生存率的影響沒(méi)有顯著差別。
　　 3、HIF-1αODD融合多肽對(duì)缺氧皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α、VEGF和PHD2表達(dá)的影響
　　 免疫組化學(xué)方法結(jié)果顯示VEGF主要表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中,HIF-1α和PHD2表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核;Real t

12、ime PCR及Western blot的結(jié)果顯示HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,缺氧4小時(shí)達(dá)到高峰,隨即逐漸下降,給予HIF-1αODD融合多肽能進(jìn)一步提高HIF-1αmRNA及蛋白水平的表達(dá);PHD2 mRNA及蛋白隨著缺氧時(shí)間的增加逐漸增高,HIF-1αODD融合多肽顯著提高了PHD2mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 1、我們利用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)成功培養(yǎng)出了高純度的神經(jīng)

13、元,利用神經(jīng)元特異性烯醇化酶為標(biāo)志物進(jìn)行了免疫熒光鑒定,并利用厭氧培養(yǎng)箱建立了神經(jīng)元缺氧模型,該方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、可靠實(shí)用,有效的模擬了宮內(nèi)缺氧環(huán)境,是研究體外皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧及治療的有效方法和手段,為進(jìn)一步研究胎兒宮內(nèi)缺氧奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、HIF-1αODD融合多肽能有效降低缺氧引起的體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡,提高神經(jīng)元的生存率,對(duì)神經(jīng)元的缺氧損傷具有保護(hù)作用。
　　 3、HIF-1αODD融合多肽不僅增加HIF-1