Bevacizumab靶向治療卵巢上皮性癌的臨床觀察和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌是婦科惡性腫瘤中惡性程度最高的一種，其發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位[1]，但其死亡率卻位居第一位，且發(fā)病率有呈逐年上升之趨勢[2]。其中卵巢上皮性癌又是各種類型卵巢癌中發(fā)病率和致死率最高的婦科惡性腫瘤[3]。因為卵巢組織位于盆腔深部，大部分卵巢癌患者早期多無明顯的自覺癥狀，同時卵巢癌又缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物，所以卵巢癌一般發(fā)現(xiàn)都多為中晚期。目前，卵巢癌的主要治療方式為有效的腫瘤細(xì)胞減滅手術(shù)聯(lián)合以鉑類

2、為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療，滿意的手術(shù)方式能達(dá)到最大程度的腫瘤肉眼減滅，但有些轉(zhuǎn)移灶不能通過手術(shù)徹底解決。雖然化療的早期有效率很高，但大部分卵巢癌患者容易出現(xiàn)對化療藥物的耐藥，這也就成為卵巢癌治療效果不滿意、復(fù)發(fā)率和死亡率高、5年存活率僅有30％左右的重要原因[3-8]。因此，尋找卵巢癌新的治療途徑十分必要。如今腫瘤的靶向治療已成國內(nèi)外關(guān)注的熱點，現(xiàn)已有多種分子靶向藥物用于惡性腫瘤的治療，也包括貝伐珠單抗對卵巢癌的靶向治療[9]。

3、　　貝伐珠單抗(Bevacizumab,Bev)是一種血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)抑制劑，它是VEGF重組人源化的單克隆抗體。貝伐珠單抗的分子靶向作用機(jī)制主要是其與內(nèi)源性VEGF競爭結(jié)合VEGF受體（VEGFR），使與內(nèi)源性 VEGF結(jié)合的 VEGFR減少，阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管的生成，引起原有腫瘤血管的退化和殘存血管的通透性降低[10-12]。

4、貝伐珠單抗在國外卵巢癌的靶向治療領(lǐng)域中的臨床試驗已顯示出滿意的治療效果，已有大量系統(tǒng)的臨床試驗報道。但在我們國內(nèi)，貝伐珠單抗在卵巢惡性腫瘤中的靶向治療尚缺乏大量的臨床資料報道。第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院婦產(chǎn)科對45例初治的卵巢上皮性癌患者進(jìn)行在化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療，觀察經(jīng)貝伐珠單抗治療后的近期臨床治療效果和貝伐珠單抗臨床使用的安全性。在此基礎(chǔ)上采用免疫組化S-P法檢測化療聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療后卵巢癌組織中血管內(nèi)皮生長因子（

5、VEGF）的表達(dá)及與微血管密度（MVD）的改變。同時檢測第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的98例手術(shù)（正常卵巢20例、化療50例及Ⅰ、Ⅱ期手術(shù)28例）患者的卵巢組織石蠟塊中VEGF和CD34的表達(dá)，計算MVD值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，觀察VEGF和MVD在卵巢上皮性癌中的臨床病理特征及兩者之間的相關(guān)性。
　　貝伐珠單抗在國外上市的十余年里，已在如肺癌，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中得以應(yīng)用，且2004年美國食品藥物管理局（Ame

6、rica Food Drug Administration，F(xiàn)DA）已批準(zhǔn) Bev作為治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的靶向治療藥物，在歐美地區(qū)，貝伐珠單抗在卵巢癌中的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗研究已很成熟，目前歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）已根據(jù)GOG0218及ICON7的研究結(jié)果，批準(zhǔn)貝伐珠單抗用于新確診的晚期卵巢癌的一線治療[13-15]，該批準(zhǔn)對受限于手術(shù)治療和化療的卵巢癌患者而言多了一種選擇。雖然貝伐珠單抗

7、已在中國國內(nèi)上市，但有關(guān)貝伐珠單抗在國內(nèi)卵巢癌患者治療中的臨床試驗數(shù)據(jù)報道不多。
　　同時，貝伐珠單抗對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的體外實驗文獻(xiàn)報道不多，有文獻(xiàn)指出[16]：通過CCK-8(Cell Count Kit-8)法檢測發(fā)現(xiàn)：貝伐珠單抗不影響人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的活力及生存能力。但又有文獻(xiàn)報道[17]：在體外實驗中，貝伐珠單抗能有效地降低人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增值指數(shù)，并且能促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。
　

8、　本實驗以入組的卵巢上皮性癌患者的影像學(xué)資料、血清學(xué)CA125值的變化和分組的卵巢上皮性癌組織的石蠟切片及人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株為實驗研究對象，采用統(tǒng)計學(xué)方法對入組的PT（奈達(dá)鉑+多西他賽）化療組和PT化療聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療組的卵巢上皮性癌患者進(jìn)行近期臨床效果分析評估，并觀察貝伐珠單抗的臨床使用安全性。采用免疫組化S-P法檢測分組的卵巢組織石蠟切片中VEGF的表達(dá)。用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察CD34蛋白的表達(dá)，計算微血管密度

9、（MVD）值。分析 VEGF和MVD之間的相關(guān)性，并分析它們的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系。選擇合適的貝伐珠單抗和順鉑的使用濃度，分別單獨作用人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，加藥24h、48h后用CCK-8法檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖情況；用流式細(xì)胞技術(shù)檢測貝伐珠單抗組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的24h凋亡率。選取合適的藥物濃度(貝伐珠單抗150μg/ml，順鉑3μg/ml)后二者再進(jìn)行聯(lián)合用藥，加藥24h、48h之后用CCK-8法檢測SKOV3細(xì)

10、胞的增殖情況，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測聯(lián)合用藥24h細(xì)胞凋亡率。觀察貝伐珠單抗對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞及組織的生物學(xué)影響。
　　目的：
　　1．觀察貝伐珠單抗靶向治療后卵巢上皮性癌患者的臨床治療效果；
　　2．觀察卵巢上皮性癌組織石蠟切片中VEGF的表達(dá)，用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察CD34的表達(dá)，計算微血管密度（MVD）值，分析VEGF和MVD之間的相關(guān)性，并分析它們的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系；
　　3．檢測貝伐

11、珠單抗和順鉑對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響；
　　4．探討貝伐珠單抗對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用。
　　方法及內(nèi)容：
　　1．與PT方案化療對比，觀察PT聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療卵巢上皮性癌患者的近期臨床治療效果，并評價貝伐珠單抗的臨床安全性；
　　2．檢測VEGF和MVD分別在正常卵巢組、早期手術(shù)組、PT化療組、及PT+Bev組卵巢組織石蠟切片中的表達(dá)，分析 VEGF和MVD之間的相關(guān)性，并分析它

12、們的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系；
　　3．檢測不同濃度的貝伐珠單抗（50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μug/ml）和不同的順鉑使用濃度（1.5μg/ml，3μg/ml，6μg/ml，9μg/ml）分別單獨作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，加藥24 h、48 h后用CCK-8法檢測人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖情況；用流式細(xì)胞儀檢測貝伐珠單抗組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的24h凋亡率；
　　4．選取合適的藥物濃度

13、(貝伐珠單抗150μg/ml，順鉑3μg/ml)，二者進(jìn)行聯(lián)合用藥，加藥24 h、48 h后用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測SKOV3細(xì)胞的24h細(xì)胞凋亡率；
　　5．觀察貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　1．觀察近期臨床治療效果及不良反應(yīng)：入組的所有患者至少完成6-8個周期的PT方案化療，PT化療聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療至少3-6個周期，所有患者均可評價近期臨床療

14、效、血清學(xué)CA125值及不良反應(yīng)。入組患者共完成670個周期化療，貝伐珠單抗使用次數(shù)為183次，中位次數(shù)為6次?；颊吣壳暗纳嫫跒?-16個月。觀察PT方案化療組50例患者化療后的近期療效為：CR:3例（6%），PR:27例（54%），SD:12例（24%），PD:8例（16%），ORR:（60.0%），DCR:（84.0%）。PT化療+Bev組45例患者的近期療效為：CR:7例（15.6%），PR:28例（62.2%），SD:7例（1

15、5.6%），PD:3例（6.6%），客觀有效率ORR:（77.8%），疾病控制率DCR:（93.3%）。PT+Bev組出現(xiàn)與貝伐珠單抗相關(guān)的不良反應(yīng)為皮疹和蛋白尿，皮疹1例:1/45(1.2%)，停藥后皮疹消失；蛋白尿2例：2/45（4.4%），未給予特殊治療2天后復(fù)查尿蛋白轉(zhuǎn)陰。未出現(xiàn)血栓栓塞、心衰、胃腸穿孔等嚴(yán)重不良反應(yīng)。出現(xiàn)了脫發(fā)、惡心、嘔吐、食欲減退、全身乏困、骨髓抑制及肝臟毒性等化療常見的不良反應(yīng)，上述癥狀經(jīng)過對癥治療后緩解或

16、消失，患者可安全完成治療。對 PT組和PT+Bev組患者的血清學(xué) CA125均值進(jìn)行連續(xù)10次檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析比較，結(jié)果顯示：PT+Bev組的卵巢上皮性癌患者血清學(xué)CA125的均值變化明顯。
　　2．VEGF和MVD分別在正常卵巢組、早期手術(shù)組、PT組、及PT+Bev組卵巢組織石蠟切片中的表達(dá)情況比較: VEGF在正常卵巢組、早期手術(shù)組、PT化療組和PT+Bev組的陽性表達(dá)率分別為：45%、92.9%、69.6%和41.9%

17、。卵巢癌組織中的VEGF的表達(dá)水平明顯高于其在正常卵巢組織中的表達(dá)（?2=13.5，p<0.05）。早期手術(shù)組、PT組和PT+Bev組的MVD值分別為51.2?2.08條、34.5±0.85條、16.67?0.93條。入組的卵巢上皮性癌組織中VEGF和MVD表達(dá)的相關(guān)性分析：VEGF的表達(dá)和MVD值呈正相關(guān)關(guān)系。從臨床病理學(xué)特征看：VEGF表達(dá)和MVD值隨腫瘤組織學(xué)分級的增高而減低。
　　3．CCK-8及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：貝伐珠

18、單抗聯(lián)合順鉑對SKOV3細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用(P<0.05)，貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑用藥的抑制率均大于各單獨用藥組。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果：貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑用藥組對SKOV3細(xì)胞的促凋亡作用要高于順鉑的單獨作用，貝伐珠單抗對SKOV3細(xì)胞無促凋亡作用。三組藥物對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而增強(qiáng)。貝伐珠單抗、順鉑和貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑這三組藥物對 SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率表現(xiàn)出一定的濃度和時間依賴性。同時

19、，計算貝伐珠單抗和順鉑兩藥的相互作用系數(shù)CDI：CDI<1，表明貝伐珠單抗和順鉑兩藥之間為協(xié)同作用，我們推論貝伐珠單抗對順鉑作用SKOV3細(xì)胞可能有一定的增敏作用，貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑是否可以降低順鉑的使用劑量，減少順鉑使用后的毒副反應(yīng)，延長化療藥物的作用時間。
　　結(jié)論：
　　1．化療聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療卵巢上皮性癌近期臨床治療效果良好，除了出現(xiàn)化療常見的不良反應(yīng)外，未出現(xiàn)惡性高血壓、血栓、胃腸道穿孔等嚴(yán)重的并發(fā)癥。為患者

20、的手術(shù)治療創(chuàng)造了良好條件?；熉?lián)合貝伐珠單抗靶向治療對卵巢上皮性癌患者血清學(xué)CA125均值的下降有很好的促進(jìn)作用。
　　2．卵巢上皮性癌組織中VEGF表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織中VEGF的表達(dá)。PT化療聯(lián)合貝伐珠單抗靶向治療后VEGF蛋白的表達(dá)水平下降，卵巢上皮性癌組織中MVD值明顯高于正常卵巢組織中的MVD值。貝伐珠單抗靶向治療后MVD值下降明顯。卵巢上皮性癌組織中 VEGF和MVD的表達(dá)隨腫瘤組織學(xué)分級的增高而減低。卵巢上皮