β-catenin抗氧化應(yīng)激所致人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、皮膚細(xì)胞的內(nèi)源性衰老和外源性衰老有著共同的分子機(jī)制，即均遭受ROS所致的氧化應(yīng)激，并發(fā)生一系列后續(xù)效應(yīng)，共同影響著皮膚細(xì)胞乃至皮膚的衰老。因此，尋找皮膚衰老相關(guān)的重要靶分子，有效控制氧化應(yīng)激延緩皮膚細(xì)胞衰老，是皮膚美容科最緊迫的使命。
　　 β-catenin是轉(zhuǎn)錄因子共激活劑，它在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和衰老方面有著非常重要的作用。然而，β-catenin的活化在影響人皮膚成纖維細(xì)胞的壽命方面我們知之甚少。本課題為了闡明β-

2、catenin調(diào)控皮膚衰老的可能的作用機(jī)制，我們?cè)贜HSFs中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-β-catenin，然后用H2O2處理誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老。我們發(fā)現(xiàn)在該衰老模型中β-catenin的mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)了，并且延緩了許多衰老表型，如：改變了細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞凋亡，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶以及細(xì)胞活性氧，超氧化物歧化酶的活性，同時(shí)上調(diào)了抗衰老相關(guān)基因FoxO3a，SMP30和Tbx3的表達(dá)，以及下調(diào)了致衰老標(biāo)志性基因p16INK

3、4a的轉(zhuǎn)錄。本課題試圖從基因水平來(lái)闡明β-catenin調(diào)控人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的可能的作用機(jī)制，并努力尋找皮膚衰老相關(guān)的重要靶分子，為未來(lái)開(kāi)發(fā)抗皮膚衰老的藥物尋找可能的作用靶點(diǎn)。
　　 第一章氧化應(yīng)激所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老中β-catenin的表達(dá)研究。
　　 目的：觀察β-catenin在氧化應(yīng)激(hydrogen peroxide，H2O2)所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老中的變化，探討其在應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚衰老中可能的

4、作用。
　　 方法：從兒童包皮分離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，H2O2處理第2～4代人皮膚成纖維細(xì)胞，顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)改變，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶細(xì)胞衰老試劑盒(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)檢測(cè)，RT-PCR、Western blot檢測(cè)β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：150μmol/L H2O2處理2h后可以誘導(dǎo)正常人皮膚成纖維細(xì)胞(

5、normal human skin fibroblasts，NHSFs)衰老。在衰老細(xì)胞(NHSFs+H2O2)中SA-β-gal陽(yáng)性率達(dá)到約(37.67±1.53)％，而正常人皮膚成纖維細(xì)胞(normal human skin fibroblasts，NHSFs)組中SA-β-gal陽(yáng)性率只有(2.97±0.25)％，兩組比較有顯著性差異(p=0.000<0.01)。RT-PCR的結(jié)果顯示，在NHSFs組中β-catenin/GAPD

6、H mRNA比值為0.59±0.04，NHSFs+H2O2組中β-catenin/GAPDH mRNA比值為0.29±0.30，NHSFs組β-catenin/GAPDH mRNA比值明顯高于NHSFs+H2O2組，兩組比較具有顯著性差異(t=10.062，p=0.001<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，NHSFs組β-catenin/GAPDH蛋白比值為0.62±0.03，NHSFs+H2O2組β-catenin/GAP

7、DH蛋白比值為0.31±0.01。NHSFs組β-catenin/GAPDH蛋白比值明顯高于NHSFs+H2O2組，兩組比較具有顯著性差異(t=14.971，p=0.000<0.01)。
　　 結(jié)論：150μmol/L H2O2處理2h可以誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老改變，應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平明顯降低，我們初步推測(cè)β-catenin可能是調(diào)控皮膚衰老的重要的靶基因，這將為研究抗皮膚衰老提供新的思路和線(xiàn)索

8、。
　　 第二章高表達(dá)的β-catenin延緩氧化應(yīng)激所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)表型的研究。
　　 目的：觀察氧化應(yīng)激(hydrogen peroxide，H2O2)所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老表型的變化，以及高表達(dá)的β-catenin對(duì)衰老表型的影響。
　　 方法：我們先在NHSFs中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-β-catenin，然后通過(guò)H2O2處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型。研究高表達(dá)的β-catenin對(duì)細(xì)胞

9、形態(tài)，細(xì)胞凋亡，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶以及細(xì)胞活性氧，超氧化物歧化酶的活性的影響。
　　 結(jié)果：高表達(dá)的β-catenin延緩了許多衰老表型，包括：改變了細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞凋亡，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶以及細(xì)胞活性氧，超氧化物歧化酶的活性。
　　 結(jié)論：我們的數(shù)據(jù)表明了β-catenin轉(zhuǎn)錄因子延緩了人皮膚成纖維細(xì)胞衰老，推測(cè)β-catenin在調(diào)控人皮膚成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)壽方面有著重要的作用。
　　 第三章β-ca

10、tenin對(duì)氧化應(yīng)激所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的保護(hù)機(jī)制研究。
　　 目的：觀察高表達(dá)的β-catenin對(duì)氧化應(yīng)激(hydrogen peroxide，H2O2)所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老模型中衰老靶基因FoxO3a，SMP30，Tbx3和p16INK4a表達(dá)的影響。
　　 方法：我們先在NHSFs中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-β-catenin，然后通過(guò)H2O2處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型。研究高表達(dá)的β-catenin