UPS-SUMO系統(tǒng)參與異氟烷預處理誘導神經保護作用的機制研究.pdf

1、近年來，針對包括圍術期腦損傷在內的腦缺血損傷的研究已成為神經科學領域的研究重點，如何防治腦缺血損傷也成為科學界急需解決的重大醫(yī)學問題，因此充分調動神經系統(tǒng)的內源性保護機制，進一步探索理想有效的神經保護措施顯得尤為關鍵。我們課題組早在前期研究中發(fā)現，在缺血損傷前給予吸入性麻醉藥例如異氟烷、七氟烷等，可減小腦梗死面積誘導缺血耐受，從而發(fā)揮神經保護作用。然而，異氟烷預處理神經保護效應的作用機制尚未明確，蛋白質的合成、翻譯及修飾作為細胞生存及功

2、能實現的重要途徑，是否介導腦缺血損傷及異氟烷預處理過程呢？
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）與其衍生的SUMO系統(tǒng)，分別介導泛素化和S UMO化這兩個重要的蛋白調控途徑，與細胞命運密切相關。研究發(fā)現異常泛素化蛋白聚集與神經細胞損害密切相關，然而SUMO蛋白并不促使蛋白質降解，而是加強蛋白穩(wěn)定性。有研究者對冬眠動物的研究中發(fā)現，損傷或應激狀態(tài)下神經元內結合型SUMO蛋白的增加可能對提高細胞對缺血缺氧等損傷的耐受具有重要意義。那么我們

3、進一步思考，作為細胞調節(jié)中的兩個重要系統(tǒng)UPS和SUMO，二者在腦缺血損傷及預處理神經保護效應中是如何發(fā)揮作用并相互調節(jié)的？
　　本課題旨在揭示UPS/SUMO系統(tǒng)參與腦缺血損傷及神經保護效應的機制，將有助于提高我們對腦缺血損傷的認識，并為未來尋找基于UPS/S UMO系統(tǒng)的新的藥物或干預措施應用于臨床神經保護奠定基礎。
　　實驗一異氟烷預處理對神經細胞氧糖剝奪損傷具有保護作用
　　目的：研究異氟烷預處理對培養(yǎng)的類神經

4、元細胞缺氧損傷的神經保護效應。
　　方法：采用SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞系經過視黃酸刺激后，誘導分化成為類神經元細胞，通過檢測神經元標志物NeuN和βⅢ-Tublin的表達變化，確定誘導分化成類神經元細胞的時間。進一步觀察異氟烷預處理對氧糖剝奪（O xyge n-glucose deprivation，OGD）損傷細胞的神經保護作用。細胞為分4組：Sham組、Iso組（單純吸烷組）、OGD組（氧糖剝奪組）、IsoPC組（異氟烷

5、預處理組）。Iso組和IsoPC組均給予2％異氟烷單次吸入2 h，OGD組和IsoPC組均進行氧糖剝奪損傷4 h，并且在異氟烷預處理24 h后進行。分別在復氧后24 h后進行M TT比色法、流式細胞儀以及檢測caspase-3含量以判斷各組細胞活性和細胞凋亡，證實異氟烷預處理對細胞氧糖剝奪損傷的保護作用。
　　結果：加入視黃酸刺激誘導分化7天后的SH-SY5Y神經標志物表達最強，因此在后續(xù)實驗中選擇誘導分化7天的細胞進行檢測。缺氧

6、損傷后24 h，細胞凋亡率增加，細胞活性降低，給予單次異氟烷預處理可以增加細胞存活率，減少細胞凋亡。
　　結論：視黃酸刺激可以誘導SH-SY5Y細胞分化成類神經元細胞；單次異氟烷預處理對氧糖剝奪損傷模型的細胞具有神經保護作用。
　　實驗二異氟烷預處理對大鼠局灶性腦缺血損傷具有腦保護作用
　　目的：研究異氟烷預處理誘導的大鼠缺血耐受效應。
　　方法：SD大鼠隨機分為4組：Sham組（空白對照組）、Iso組（單純吸烷

7、組）、MCAO組（缺血損傷組）、IsoPC組（異氟烷預處理組）。Iso組和IsoPC組連續(xù)5天每天吸入2%異氟烷1 h；MCAO組和IsoPC組進行大腦中動脈阻閉模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO），缺血時間為120 min，缺血模型在異氟烷預處理后24 h進行。缺血再灌注后不同時間點24 h、48 h、72 h、7 d分別進行神經功能學評分（Neurological behavioral

8、score，NBS）以及TTC染色評估腦梗死容積百分比，證實異氟烷預處理對大鼠局灶性腦缺血損傷模型的神經保護作用。
　　結果：在局灶性腦缺血損傷后24 h，大鼠神經功能學評分相比Sham組降低，腦梗死容積明顯，隨著再灌注時間延長，腦梗死容積逐漸縮小。給予異氟烷預處理可以明顯減小腦梗死容積百分比，提高神經功能學評分，減輕大腦中動脈阻塞模型對腦組織的損傷作用。說明異氟烷預處理對于局灶性腦缺血損傷具有腦保護作用。
　　結論：異氟烷

9、預處理對局灶性腦缺血損傷具有短期神經保護效應。
　　實驗三異氟烷預處理通過抑制結合型泛素蛋白聚集誘導腦缺血耐受
　　目的：研究泛素系統(tǒng)在腦缺血損傷和異氟烷預處理中的作用。
　　方法： SD大鼠隨機分為5組：Sha m組（空白對照組）、MC AO24 h組（缺血損傷后24 h組）、IsoPC24 h組（預處理保護24 h組）、MCAO72 h組（缺血損傷后72 h組）、IsoPC72 h組（預處理保護72 h組）（每組8

10、只）。除了Sham組以外，其它4組均進行MCAO模型，IsoPC24 h組和IsoPC72 h組在MCAO模型前24 h給予連續(xù)5天2%異氟烷吸入每天1 h。分別在損傷后24 h和72 h進行取材，分別進行Ubiquitin蛋白Western blot和免熒組化染色，了解泛素蛋白系統(tǒng)在腦缺血損傷及異氟烷預處理后不同時相的變化趨勢和分布特點。
　　結果：免疫熒光結果顯示局灶性腦缺血損傷后24 h即可觀察到異常泛素蛋白的聚集，并且在損

11、傷后72 h均維持在高表達，異氟烷預處理可以明顯減少泛素蛋白的表達。Western blot結果也顯示，損傷后結合型泛素蛋白表達增加，游離型泛素蛋白減少，異氟烷預處理可以完全逆轉泛素蛋白的表達，從而發(fā)揮神經保護作用。
　　結論：異氟烷預處理抑制缺血后結合型泛素蛋白的聚集，發(fā)揮腦保護作用。
　　實驗四異氟烷預處理通過改變SUMO系統(tǒng)蛋白表達誘導神經保護作用
　　目的：研究異氟烷預處理對SUMO系統(tǒng)蛋白和Ubc9蛋白表達的

12、影響。
　　方法：實驗分為離體實驗和在體實驗。離體實驗中，采用誘導分化成功的SH-SY5Y細胞系進行實驗，細胞共分為4組：S ha m組、Iso組、O GD組、IsoPC組，在復氧后24h進行免疫熒光染色和Western blot檢測，觀察SUMO-1、SUMO-2/3、Ubc9蛋白的細胞分布特點及表達變化。在體實驗中，將第四軍醫(yī)大學實驗動物中心的SD大鼠隨機分為6組：Sham組、Iso組、MCAO4 h組、IsoPC4h組、MC

13、AO24 h組、IsoPC24 h組（每組8只）。在再灌注后4 h和24 h分別進行免疫熒光染色和Western blo t檢測，觀察 SUMO系統(tǒng)和Ubc9蛋白在腦組織中的表達及蛋白含量變化。明確SUMO系統(tǒng)以及SUMO連接酶Ubc9參與缺血損傷和神經保護作用的機制。
　　結果：離體實驗中，在OGD損傷后24 h，結合型SUMO-1表達減少，游離型SUMO-1表達增加，異氟烷預處理可以上調結合型SUMO-1蛋白表達，抑制游離型S

14、UMO-1水平；然而結合型 S UMO-2/3在損傷后表達升高，異氟烷預處理可減少SUMO-2/3表達；復氧4 h和24 h后Ubc9的表達均明顯減少，且在4 h達到最低，異氟烷預處理可以增加Ubc9的表達，但是在損傷后24 h影響不明顯，無統(tǒng)計學意義。在體實驗中SUMO-1的表達減少，在24 h基本恢復到正常水平，異氟烷預處理可以逆轉缺血對SUMO-1表達的抑制作用；缺血損傷可以增加結合型SUMO-2/3蛋白的聚集，但是異氟烷預處理對

15、結合型SUMO-2/3的表達沒有影響；Ubc9在缺血后表達下調，異氟烷預處理可以增加Ubc9的表達。說明SUMO系統(tǒng)參與缺血損傷及異氟烷預處理作用。
　　結論：異氟烷預處理通過調節(jié)S UMO蛋白和Ubc9蛋白的表達調控神經保護作用。
　　實驗五調控Ubc9對異氟烷預處理的神經保護作用影響研究
　　目的：研究調控SUMO化的E2酶Ubc9蛋白異氟烷預處理誘導神經保護效應的影響。
　　方法：實驗分為離體實驗和在體實驗

16、兩部分。離體實驗中，采用慢病毒轉染的方法構建穩(wěn)定過表達Ubc9的SH-SY5Y細胞系，用siRNA下調細胞Ubc9的表達，之后再進行異氟烷預處理和OGD模型。實驗分為8組：Sham組、Iso組、OGD組、IsoPC組、Lenti+OGD組（過表達慢病毒+氧糖剝奪損傷組）、Lenti+IsoPC組（過表達慢病毒組+異氟烷預處理組）、siRNA+OGD組（小干擾 RNA+氧糖剝奪損傷組）、siRNA+IsoPC組（小干擾RNA+異氟烷預處理

17、組）。復氧后24 h通過MTT比色法和檢測caspase-3的含量觀察類神經元在氧糖剝奪損傷后和異氟烷預處理后細胞活性和細胞凋亡程度。在體實驗中，給予大鼠側腦室微注射siRNA，下調大鼠腦組織中Ubc9的表達，隨后進行異氟烷預處理和大腦中動脈阻閉模型。實驗分為6組：Sha m組、Iso組、MCAO組、IsoPC組、siRNA+MCAO組、siRNA+IsoPC組（每組8只）。在再灌注損傷后24 h評估神經功能學評分和觀察腦梗死容積百分比

18、，證實S UMO連接酶Ubc9在異氟烷預處理誘導缺血耐受中的作用機制。
　　結果：慢病毒過表達載體可以增加細胞Ubc9和SUMO-1的表達，siRNA可以抑制Ubc9和SUMO-1的蛋白水平，但是二者對SUMO-2/3的表達均沒有影響。上調Ubc9的表達可以模擬神經保護作用；下調Ubc9蛋白可以增加細胞對氧糖剝奪損傷的敏感性，并且逆轉異氟烷預處理的神經保護作用。給予大鼠側腦室微注射siRNA-Ubc9可以下調大鼠腦組織Ubc9的表