神經(jīng)肽Y對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子和小分子炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)的研究表明，炎癥反應(yīng)在疾病譜中發(fā)病率和死亡率居前以及因病所致負(fù)擔(dān)嚴(yán)重的慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，如惡性腫瘤、心腦血管疾病、代謝性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制精確而又復(fù)雜，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的共同參與和調(diào)節(jié)。神經(jīng)(內(nèi)分泌)-免疫網(wǎng)絡(luò)在調(diào)節(jié)炎癥以及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。
　　 神經(jīng)肽Y(NeuropeptideY，NPY)是由36個(gè)氨基酸組成的多肽，1982年由瑞典

2、的Karolinska學(xué)院的Tatemoto和Mutt從400kg豬腦組織中純化出來(lái)的。NPY廣泛分布于中樞和外周組織，尤以神經(jīng)系統(tǒng)的含量為高。NPY在中樞的主要作用包括對(duì)學(xué)習(xí)、記憶、攝食、生殖內(nèi)分泌等功能的影響。除了上述功能以外，NPY在哺乳動(dòng)物免疫功能的調(diào)節(jié)方面以及在一些自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸被揭示。在外周，交感神經(jīng)是NPY釋放的一大重要來(lái)源。有研究表明，外周交感神經(jīng)廣泛支配著外周免疫器官，在一些局部組織，出現(xiàn)了交感神

3、經(jīng)末梢和巨噬細(xì)胞形成的“類突觸”樣結(jié)構(gòu)，這為NPY直接調(diào)節(jié)局部炎癥以及巨噬細(xì)胞功能提供了生理解剖基礎(chǔ)。
　　 巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要組成細(xì)胞，由外周血單核細(xì)胞分化而來(lái)，幾乎分布于機(jī)體的各種組織中?；罨木奘杉?xì)胞通過(guò)分泌多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1以及大量炎性介質(zhì)如白三烯、前列腺素、彈性蛋白酶、溶菌酶、尿激酶等，加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)。因此，在細(xì)胞和分子水平，明確NPY對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子和小分子炎性介

4、質(zhì)的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，是神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)方面研究亟待解決的問(wèn)題。
　　 系統(tǒng)生物學(xué)是研究一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分(基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物等)的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間相互關(guān)系的學(xué)科。代謝組學(xué)(metabonomics)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支，是一種新的整體性的分析技術(shù)，它是研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物變化的科學(xué)，所關(guān)注的是代

5、謝循環(huán)中分子量小于1000的小分子代謝物的變化，反映的是外界刺激或遺傳修飾的細(xì)胞或組織的代謝應(yīng)答變化。因此，通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)，可以獲得NPY作用下巨噬細(xì)胞小分子炎性介質(zhì)的改變，明確其具體調(diào)節(jié)作用。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)功能的執(zhí)行者，生物體結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的改變必然在蛋白組水平上表現(xiàn)出來(lái)。通過(guò)液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜鑒定可以獲得關(guān)于蛋白質(zhì)組的變化信息，并通過(guò)生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)調(diào)研，尋找可能改變的信號(hào)通路或分子，為進(jìn)一步闡述NPY的作用機(jī)理提供了高效的研

6、究手段。
　　 本課題以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。首先，采用LPS刺激巨噬細(xì)胞造成炎性激活模型。在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)NPY對(duì)巨噬細(xì)胞主要炎性因子分泌的影響，并通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)，研究NPY對(duì)巨噬細(xì)胞小分子炎性介質(zhì)分泌的影響。進(jìn)一步，通過(guò)分別提取NPY作用下巨噬細(xì)胞胞核和胞漿部分的蛋白質(zhì)組，應(yīng)用納升級(jí)二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(2D-nano-LC-MS/MS)技術(shù)獲得關(guān)于蛋白質(zhì)組的變化信息，從中推測(cè)NPY的作用機(jī)制；針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)得出的

7、結(jié)果以及NPY可能的信號(hào)通路，研究NPY炎性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，具體內(nèi)容包括：
　　 1.本文首先建立了LPS刺激巨噬細(xì)胞造成的炎癥模型，發(fā)現(xiàn)NPY能夠抑制巨噬細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，但是有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高巨噬細(xì)胞晚期炎癥因子HMGB1的分泌，而且該作用并非由于巨噬細(xì)胞壞死所導(dǎo)致的被動(dòng)釋放，而是巨噬細(xì)胞的主動(dòng)分泌所致。通過(guò)mRNA水平的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)NPY能夠快速提高HMGB1mRNA的轉(zhuǎn)錄，

8、其較LPS的提高mRNA水平的時(shí)間更快。接下來(lái)，我們應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了LPS處理組合NPY+LPS處理組上清液中分子量小于1000的小分子代謝物的變化。主成分分析結(jié)果顯示，NPY處理改變了炎癥激活巨噬細(xì)胞的分泌模式。通過(guò)確認(rèn)代謝產(chǎn)物類似分子離子后，我們發(fā)現(xiàn)NPY能夠顯著下調(diào)兩種炎癥介質(zhì)脂氧素A4(0.53倍)和前列腺素B2(0.54倍)的分泌。本文的研究結(jié)果顯示NPY能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生

9、，能夠提高晚期炎癥因子HMGB1的主動(dòng)分泌和mRNA水平。并且能夠改變炎癥激活巨噬細(xì)胞的分泌模式，下調(diào)小分子炎癥介質(zhì)脂氧素A4(0.53倍)和前列腺素B2(0.54倍)的分泌。
　　 2.NPY能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥因子和小分子炎性介質(zhì)的分泌。為了探索其中的分子機(jī)制，我們采用了基于2D-nano-LC-MS/MS的高通量蛋白組學(xué)研究技術(shù)，研究RAW264.7細(xì)胞在10-8mol/L處理后，在胞內(nèi)不同空間蛋白表達(dá)上呈現(xiàn)的差異，從而探

10、索NPY炎性調(diào)節(jié)可能的信號(hào)途徑。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)NPY處理后，RAW264.7細(xì)胞共有435個(gè)蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異。這些蛋白涵蓋了復(fù)雜的功能領(lǐng)域，包括能量代謝、細(xì)胞骨架、核酸代謝和炎癥功能等。我們選取了跟炎癥功能相關(guān)的蛋白進(jìn)行探討。最后我們發(fā)現(xiàn)，NPY可能通過(guò)改變其受體介導(dǎo)內(nèi)吞過(guò)程中的連接分子β-arrestin2的空間分布發(fā)揮了炎癥調(diào)節(jié)作用，影響了部分炎癥因子的表達(dá)。并且從本實(shí)驗(yàn)可以看出，基于2D-nano-LC-MS/MS的蛋白組學(xué)技

11、術(shù)是信號(hào)通路研究的有效手段。
　　 3.N-PY在巨噬細(xì)胞上主要通過(guò)Ⅰ型受體發(fā)揮作用，該受體屬于Gq型蛋白耦聯(lián)受體。目前關(guān)于NPY作用的分子機(jī)制罕有報(bào)道。我們結(jié)合第一部分研究觀察到的炎性因子調(diào)節(jié)和第二部分的蛋白質(zhì)組研究。我們推測(cè)NPY對(duì)TNF-α調(diào)節(jié)是由于NPY內(nèi)吞過(guò)程中β-arrestin2分子向胞核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程相關(guān)。在細(xì)胞水平我們發(fā)現(xiàn)NPY作用下β-arrestin2分子向胞核轉(zhuǎn)移。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)NPY作用下，LPS引起的NF-